熱療聯(lián)合瘤內(nèi)注射野生型p53治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景 原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，高發(fā)于東南沿海地區(qū)。我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的45﹪。值得注意的是，世界各地原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。根據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肝癌年死亡率占腫瘤死亡率的第二位。肝癌的治愈性治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、超聲消融等。肝癌的姑息性治療手段包括TACE、化療、熱療、基因治療等。手術(shù)切除仍是目前原發(fā)性肝癌有可能達(dá)到根治目的的最好治療方法。但原發(fā)性肝癌發(fā)展很快，很多病人就診時(shí)

2、往往已屬于中晚期，絕大多數(shù)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。而且據(jù)國(guó)內(nèi)資料報(bào)道，既使是小肝癌的根治切除，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率也達(dá)43.5﹪。因此尋找一種既有效、可靠、又能降低復(fù)發(fā)率而且包括能針對(duì)中晚期腫瘤患者的治療方法已是迫在眉睫。近年來(lái)熱療和基因治療的進(jìn)展很快，已作為腫瘤的綜合治療手段應(yīng)用于臨床。熱療可通過(guò)多種途徑殺滅腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤血管形成，已經(jīng)應(yīng)用于臨床多種中晚期惡性腫瘤的治療，但降低其治療效果的主要原因在于升溫后腫瘤細(xì)胞的熱耐受性，而野生型p53既可

3、降低腫瘤細(xì)胞的熱耐受性，且其本身亦可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，故兩者聯(lián)合應(yīng)用可能達(dá)到一種協(xié)同效應(yīng)。本研究以BALB/c裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用接種人肝癌細(xì)胞的方法，建立荷肝癌裸鼠模型。將其隨機(jī)分成四組。分別采用局部熱療(局部水浴加熱)、瘤內(nèi)注射野生型p53基因治療、局部熱療聯(lián)合瘤內(nèi)注射野生型p53基因治療及不做處理作為對(duì)照組等四種措施，來(lái)檢測(cè)治療前后腫瘤的體積變化、瘤體內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)及瘤體微血管密度變化，并比較處理后各組移植瘤的病理切片來(lái)顯示

4、腫瘤壞死情況。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過(guò)觀察不同療法對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)及腫瘤生長(zhǎng)的影響，探索一種安全有效治療肝癌的新療法。目的①以BAIB/c裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用接種肝癌細(xì)胞的方法，建立荷肝癌裸鼠模型。并觀察動(dòng)物模型腫瘤的生長(zhǎng)情況。 ②采用熱療和瘤內(nèi)注射野生型p53基因治療兩種治療方法，觀察單獨(dú)治療及聯(lián)合治療后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及其協(xié)同作用。 探討兩者聯(lián)用的協(xié)同作用機(jī)制，為對(duì)肝癌治療采用一種新的有效療法提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料

5、與方法 1．體外培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞解凍HepG2細(xì)胞，并將其置于含10﹪新鮮胎牛血清的DMEM液中常規(guī)培養(yǎng)并傳代。待各培養(yǎng)瓶中HepG2細(xì)胞長(zhǎng)滿后，將其收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5×10<'6>/0.2ml，以備注射。 2．建立皮下荷肝癌裸小鼠模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。 將細(xì)胞密度為5×10<'6>/0.2的HepG2細(xì)胞懸液注射于裸小鼠后肢背部皮下，每只注射0.2ml，建立皮下荷肝癌裸小鼠模型。每三天用游標(biāo)卡尺測(cè)量

6、注射部位，檢測(cè)移植瘤的長(zhǎng)徑、短徑，計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。 3．實(shí)驗(yàn)分組 取32只裸鼠隨機(jī)分成四組：局部熱療組(局部水浴加熱)、瘤內(nèi)注射野生型p53組、局部熱療聯(lián)合瘤內(nèi)注射野生型p53組及對(duì)照組。并分別根據(jù)處理措施給予對(duì)應(yīng)的處理。 4．觀察指標(biāo) 分別觀察：①治療前后各組裸鼠瘤體的體積變化；②瘤體內(nèi)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比；③瘤體微血管密度變化；④觀察比較處理后各組移植瘤的病理切片。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

7、統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS(Statistical Program for Social Sciences，社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序)軟件包13.0版。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．局部熱療聯(lián)合瘤內(nèi)注射野生型p53基因治療對(duì)移植瘤生長(zhǎng)情況的影響根據(jù)模型腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看到，對(duì)照組腫瘤體積隨瘤齡延長(zhǎng)其體積明顯增大；熱療組治療后瘤體有所縮?。换蛑委熃M瘤體縮小較明顯；聯(lián)合治療組，瘤體縮小更明顯。經(jīng)治療后，瘤體生長(zhǎng)均受到抑制，但

8、聯(lián)合治療組抑制腫瘤體積效果更明顯。聯(lián)合治療組腫瘤體積與其他三組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異，P<0.05。 2．各組的移植瘤組織學(xué)的比較各治療組的瘤體HE染色顯示，對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)良好，細(xì)胞分裂相多見(jiàn)，壞死面積較低。其余各組腫瘤出現(xiàn)不同程度的腫瘤壞死，壞死相對(duì)面積大于對(duì)照組。這種現(xiàn)象以熱療基因聯(lián)合治療組最為明顯。 3．各組的移植瘤VEGF的表達(dá)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的移植瘤進(jìn)行VEGF免疫組化分析，結(jié)果示：對(duì)照組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比為

9、51.351±6.909﹪，熱療、基因治療和聯(lián)合治療后VEGF的表達(dá)分別為38.776±7.364﹪、34.975±4.234﹪、29.053±3.208﹪。熱療、基因治療和聯(lián)合治療后VEGF的表達(dá)均較對(duì)照組表達(dá)有所降低(P<0.05)。聯(lián)合治療組VEGF蛋白表達(dá)較熱療組或基因治療組降低(P<0．05)。而熱療組與基因治療組VEGF蛋白表達(dá)，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。 4．各組的移植瘤CD34的表達(dá)與以及MVD的分析

10、對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的移植瘤進(jìn)行CD34免疫組化分析，結(jié)果示：對(duì)照組CD34標(biāo)記的微血管密度為20.500±3.779，熱療、基因治療和聯(lián)合治療后MVD的表達(dá)分別為15.000±2.268、11.625±2.504、6.750±2.121。熱療、基因治療和聯(lián)合治療后CD34蛋白和MVD表達(dá)均較對(duì)照組表達(dá)降低(P<0.05)。聯(lián)合治療組CD34蛋白和MVD表達(dá)較熱療組或基因治療組表達(dá)降低(P<0.05)。 5．將VEGF與MVD進(jìn)行直線回歸

11、分析后，發(fā)現(xiàn)裸鼠移植瘤的VEGF的表達(dá)與MVD的表達(dá)有關(guān)聯(lián)，它們之間存在正相關(guān)性(r=0.749,P<0.001)。 結(jié)論 1．熱療和野生型p53基因治療都能抑制荷肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。 2．熱療抗腫瘤血管生成的作用可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 3．熱療的作用機(jī)理可能是抑制腫瘤組織VEGF的表達(dá)，減少腫瘤組織內(nèi)血管生成，并使MVD降低，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。 4．熱療和野生型p53基因聯(lián)合應(yīng)用可達(dá)到較