基因治療增敏伽瑪?shù)斗派渫饪浦委熌z質(zhì)瘤的初步研究：過表達(dá)野生型p53和靶向Ku70的RNA干涉.pdf

1、目的：人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，目前臨床上雖采用多種治療方法，但由于其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及其本身內(nèi)在放射抵抗性的特性，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不理想。試驗(yàn)研究顯示：給予外源野生型p53，可以控制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)；并且給予WTp53同時(shí)予以放療可以增強(qiáng)放射治療的療效。伽瑪?shù)杜c常規(guī)放療又有著明顯的差別，p53是否增強(qiáng)伽瑪?shù)吨委煹寞熜В谇捌趯?duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的研究中，初步認(rèn)為是有效的，但在體應(yīng)用后效果如何尚不清楚。 本研究第一部分應(yīng)

2、用C6鼠腦膠質(zhì)瘤模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從分子生物學(xué)水平進(jìn)一步探討伽瑪?shù)堵?lián)合p53基因治療膠質(zhì)瘤的機(jī)理和療效。第二部分?jǐn)M用siRNA干涉技術(shù)來降低DNA修復(fù)基因DNA-PK的調(diào)節(jié)亞基Ku70的表達(dá)，為后期的DNA-PK的RNA干涉治療聯(lián)合伽瑪?shù)斗派渫饪浦委熥骱脺?zhǔn)備。 方法：第一部分本實(shí)驗(yàn)在建立C6鼠膠質(zhì)瘤模型的基礎(chǔ)上，于6天后進(jìn)行MRI檢查，確定成瘤后隨機(jī)分為4組，每組14只(包括對(duì)照組、立體定向伽瑪?shù)吨委熃M、p53治療組及聯(lián)合治療

3、組)。Ad-p53經(jīng)293包裝細(xì)胞進(jìn)行病毒復(fù)制后，提取腺病毒，測(cè)定病毒滴度，備用。在動(dòng)物模型建立后的第6、8天進(jìn)行腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療，并于2天后隨機(jī)處死一只大鼠進(jìn)行Western雜交鑒定。第10天行立體定向伽瑪?shù)斗派渫饪浦委?，給予邊緣劑量15Gy，治療后48小時(shí)每組處死6只大鼠進(jìn)行生物學(xué)特性檢測(cè)，其余8只在伽瑪?shù)吨委熀?、2、4、8周進(jìn)行MRI檢查，并觀察生存期及生存狀態(tài)，生物學(xué)特性檢測(cè)包括HE染色、PCNA，P21，Cycli

4、nD1(免疫組化法)，凋亡(TUNEL法)。 第二部分利用半定量PCR的方法，驗(yàn)證了C6細(xì)胞系中表達(dá)Ku70；化學(xué)合成3個(gè)siRNA干涉序列，轉(zhuǎn)染C6腫瘤細(xì)胞系，依次分為干涉序列1、干涉序列2、干涉序列3、陰性對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組、和空白對(duì)照組，于轉(zhuǎn)染siRNA48小時(shí)后，進(jìn)行半定量PCR，用bandscan分析軟件分析，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)2據(jù)統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果：第一部分經(jīng)Western雜交鑒定Ad-p53成功導(dǎo)入體內(nèi)C6腫瘤細(xì)

5、胞，并高表達(dá)p53蛋白。所有對(duì)照組大鼠均于21天以內(nèi)死亡，平均生存時(shí)間18.7±0.45天；于56天觀察期內(nèi)，p53治療組和伽瑪?shù)吨委熃M分別有2、4只大鼠生存，生存率分別為25％和50％，而聯(lián)合治療組有6只生存，生存率為75％，結(jié)果行Kaplan-Meier曲線分析；MRI顯示治療組腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮??；聯(lián)合治療組HE染色切片中，壞死范圍較單一伽瑪?shù)吨委熃M明顯增大，但p53治療組與對(duì)照組比較變化不明顯；所有治療組PCNA表達(dá)均比對(duì)照

6、組下降，而聯(lián)合治療更加明顯(P＜0.001)；細(xì)胞周期蛋白cyclinD1明顯下調(diào)(P＜0.001)，細(xì)胞周期素蛋白依賴性激酶抑制因子p21明顯上調(diào)(P＜0.001)；TUNEL原位凋亡檢測(cè)證實(shí)，聯(lián)合治療組細(xì)胞凋亡率明顯高于單一治療組(P＜0.001)。 第二部分經(jīng)SQ-RT-PCR檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)Ku70基因，轉(zhuǎn)染siRNA行序列優(yōu)選，表明干涉序列1可明顯降低Ku70基因的表達(dá)，與空白對(duì)照組差異明顯(P＜0.001)，

7、而干涉序列2、3與空白對(duì)照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) 結(jié)論：第一部分伽瑪?shù)斗派渫饪浦委烠6荷瘤SD大鼠模型，可以使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的壞死，并隨著邊緣劑量的衰減，壞死程度逐漸減輕；并可抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤的增殖率；下調(diào)細(xì)胞周期素D1，上調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子p21，產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯；促進(jìn)凋亡。p53治療C6荷瘤SD大鼠模型，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，并產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。伽瑪?shù)斗派渫饪浦委熉?lián)合p53基因治療C