腺病毒介導(dǎo)的RPL23基因轉(zhuǎn)染通過對MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)抑制p53野生型胃癌細胞的生長.pdf

1、p53的失活是腫瘤轉(zhuǎn)化過程中最常見的事件之一。人類大部分腫瘤的發(fā)生和發(fā)展同p53的變異和缺失密切相關(guān)。p53在人類腫瘤中突變率很高，平均達到50％；盡管如此，仍有約50％的腫瘤表達野生型p53（wt-p53），其中多數(shù)因細胞內(nèi)降解代謝或下游信號通路的改變而致p53正常功能缺失。
　　MDM2在調(diào)節(jié)p53濃度及活性中起關(guān)鍵作用。在正常細胞中，MDM2通過對p53蛋白持續(xù)而又快速的降解使p53活性保持在一個適當?shù)乃?，這是生物體維持正

2、常生長的一種平衡調(diào)控手段。MDM2本身是p53的轉(zhuǎn)錄靶基因，因而兩者構(gòu)成負反饋環(huán)路，調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性。但在一些細胞中，由于基因擴增或其它原因?qū)е翸DM2水平的升高，從而導(dǎo)致對p53產(chǎn)生構(gòu)成性的、非正常的抑制作用，并且不可逆地促使其降解，使p53對細胞正常的調(diào)控平衡被破壞，造成細胞生長失控，因而變得具有腫瘤細胞的特性。
　　將p53從被MDM2的抑制中釋放出來或阻斷MDM2與其它基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用以恢復(fù)p53的正常功能，即可抑

3、制癌的發(fā)生或發(fā)展。已有的研究顯示，核糖體蛋白L23（RPL23）是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)MDM2-p53反饋環(huán)的一個重要分子。通過與MDM2的直接結(jié)合，RPL23抑制MDM2對p53的泛素化和降解而間接促使wt-p53功能的活化，進而誘導(dǎo)p53依賴的細胞周期阻滯和/或凋亡。此外，研究顯示外源性表達的RPL23在胞核和胞漿內(nèi)均可與MDM2結(jié)合，提示RPL23蛋白可以復(fù)合物的形式將MDM2阻滯于胞核或胞漿，進而間接抑制MDM2與p53的結(jié)合及對p53的

4、泛素化和降解。基于此，我們設(shè)想以RPL23基因為靶點的腫瘤基因治療是一可行策略。
　　目的：
　　探討腺病毒介導(dǎo)的RPL23基因轉(zhuǎn)染是否可通過對MDM2-p53相互作用的抑制誘導(dǎo)胃癌細胞內(nèi)源性wt-p53蛋白的積聚活化并進而抑制其生長。
　　方法：
　　1、利用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察p53和MDM2在胃癌組織中的表達情況；2、構(gòu)建rAd5-RPL23重組腺病毒，并利用WesternBlot、免疫沉淀及免疫熒光

5、染色等方法鑒定其對胃癌細胞MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)；3、應(yīng)用Ad-RPL23重組腺病毒轉(zhuǎn)染wt-p53型胃癌細胞系A(chǔ)GS和MKN45，觀察其對胃癌細胞周期和/或凋亡的影響，并進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，進一步驗證Ad-RPL23重組腺病毒對p53野生型胃癌的生長抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、p53和MDM2在胃癌組織中的表達及意義
　　我們利用免疫組化染色檢測了p53和MDM2在94例胃癌原發(fā)灶中的表達。結(jié)果顯示：p5

6、3（突變型）的檢出率為36％（34/94），此外，在這些可以檢出突變型p53蛋白表達的胃癌原發(fā)灶中并非所有癌細胞均是p53陽性表達，其陽性率差異比較大，從10％-99％，均數(shù)約30％，提示在胃癌原發(fā)灶中有更多的癌細胞為p53野生型；在62.8％(59/94)的胃癌原發(fā)灶中可以檢測到MDM2表達，定位于胞漿和胞核，并且呈異質(zhì)性表達；在我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDM2表達陽性率顯著高于原發(fā)灶，提示MDM2的水平增高可能與胃癌細胞的

7、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　2、Ad-RPL23重組腺病毒的構(gòu)建及其對MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)
　　本研究首先利用武漢晶賽公司AdenovirusExpressionSystem重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)成功構(gòu)建了rAd5-RPL23（Ad-RPL23），隨后利用WesternBlot、免疫共沉淀和免疫熒光等方法證實在胃癌細胞系MKN45中外源性RPL23蛋白可與內(nèi)源性MDM2蛋白相互結(jié)合并抑制其E3泛素酶活性，進而誘導(dǎo)wt-p53蛋白

8、的積聚活化。進一步實驗，我們證實Ad-RPL23誘導(dǎo)的p53活化源于其對MDM2降解p53過程的抑制。
　　3、Ad-RPL23轉(zhuǎn)染對胃癌細胞細胞周期和/或凋亡的影響
　　Ad-RPL23轉(zhuǎn)染后，p53野生型人胃癌細胞系MKN45和AGS出現(xiàn)G1-S期阻滯，WesternBlot結(jié)果顯示，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染的MKN45和AGS細胞p53蛋白表達水平與MDM2蛋白表達水平具有一致性，顯示外源性RPL23表達可抑制MDM2-p

9、53相互作用并引起p53積聚活化，進而誘導(dǎo)p21的表達。此外，在MKN45細胞中，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染可以誘導(dǎo)明顯的細胞凋亡，WesternBlot結(jié)果顯示，作為p53轉(zhuǎn)錄的靶基因，Bax和PUMA，兩個已知的凋亡相關(guān)分子，表達均明顯上調(diào)。在p53突變型胃癌細胞系MGC803中，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染對細胞周期及凋亡未有影響，顯示外源性的RPL23是通過p53途徑發(fā)揮其抑癌效應(yīng)的。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗進一步證實了上述結(jié)果?？傊緦嶒炋峁┑臄?shù)