腺病毒介導(dǎo)PPAR-γ1基因腦室內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠缺血再灌注腦的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分、大鼠缺血再灌注腦組織PPAR-γ1表達(dá)變化
　　 目的:研究缺血再灌注大鼠腦組織PPAR-γ1mRNA和蛋白的表達(dá)變化,并結(jié)合文獻(xiàn)分析其和腦缺血再灌注損傷的關(guān)系。
　　 方法:建立SD大鼠右側(cè)MCAO缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、假手術(shù)組和缺血再灌注組。缺血再灌注組取缺血后12h、24h和48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。用RT-PCR方法及Westem blotting方法分別檢測(cè)PPAR-γ1mRNA和蛋白的表達(dá)

2、。
　　 結(jié)果:腦缺血再灌注組PPAR-γ1mRNA和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組和假手術(shù)組明顯降低。通過(guò)對(duì)缺血后12h、24h和48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化觀察發(fā)現(xiàn),缺血后12h表達(dá)最低,并且隨缺血后時(shí)間的推移,其表達(dá)逐漸增加,存在顯著性差異。但缺血后48h的表達(dá)值仍低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組。
　　 結(jié)論:實(shí)驗(yàn)SD大鼠缺血再灌注腦組織PPAR-γ1表達(dá)下調(diào),提示針對(duì)PPAR-γ1作為一靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)對(duì)于缺血性腦血管病的治療是一個(gè)新

3、的研究方向。
　　 第二部分、腺病毒介導(dǎo) PPAR-γ1基因腦室內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠缺血再灌注腦的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 目的:
　　 1.研究通過(guò)腦室內(nèi)途徑腺病毒載體轉(zhuǎn)染PPAR-γ1到腦的可行性,如果可行則進(jìn)一步觀察其對(duì)缺血再灌注腦是否具有保護(hù)作用。
　　 2.過(guò)表達(dá)PPAR-γ1基因和PPAR-γ激活劑吡格列酮合用,觀察其對(duì)腦I/R保護(hù)作用是否有增強(qiáng)。
　　 3.研究PPAR-γ1對(duì)IL-1β、ICA

4、M-1、Bcl-2、Bax、MMP-9和AOP-4的影響及抗腦I/R損傷的機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)構(gòu)建復(fù)制缺陷性重組腺病毒:采用分子克隆手段獲得攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組質(zhì)粒、攜帶PPAR-γ1基因的重組質(zhì)粒,以細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒Adv-EGFP、Adv-PPAR-γ1,在293細(xì)胞內(nèi)分別擴(kuò)增,應(yīng)用氯化銫密度梯度離心法純化病毒。
　　 (2)選擇95只SD大鼠隨機(jī)

5、分成6組。按照包新民等報(bào)道的定位方法,在立體定位儀下給大鼠腦室內(nèi)注射相應(yīng)試劑0.1ml。第1、2組注入不含PPAR-γ1基因的生理鹽水0.1ml,第3組注入Adv-PPARγ10.1ml,第4注入Adv-EGFP0.1ml,第5組吡格列酮5mg/kg灌胃Qd×3天,第6組腦室內(nèi)注入Adv-PPARγ10.1ml+吡格列酮5mg/kg灌胃Qd×3天。
　　 (3)3天后建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。第1組為假手術(shù)組,不阻斷

6、大鼠大腦中動(dòng)脈。第2-6組阻斷大腦中動(dòng)脈90分鐘再灌注24小時(shí)。
　　 (4)采集腦組織標(biāo)本,采用TTC染色法測(cè)量腦梗死體積;伊文氏藍(lán)法測(cè)定血腦屏障通透性;干-濕重法測(cè)定腦含水量;光鏡、電鏡下進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光顯微鏡下觀察腺病毒表達(dá)情況;腦組織MPO活性測(cè)定;用Western Blot方法檢測(cè)缺血區(qū)腦組織IL-1β、ICAM-1、Bcl-2、Bax、AQP-4、MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:腦室內(nèi)途徑腺病

7、毒載體轉(zhuǎn)染Adv-EGFP,免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性。腦缺血再灌注后,腦梗死體積增大、血腦屏障通透性增加、腦組織含水量增加、MPO活性明顯增高,IL-1β、ICAM-1、Bax、AOP-4和MMP-9蛋白的表達(dá)增加,Bcl-2蛋白表達(dá)減少。腦室內(nèi)注射Adv-PPARγ1或吡格列酮灌胃均能抑制以上腦損傷指標(biāo)以及IL-1β、ICAM-1、Bax、AQP-4和MMP-9的蛋白表達(dá)上調(diào),而使Bcl-2蛋白表達(dá)增加。它們聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能增強(qiáng)保護(hù)作用。

8、　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)腦室內(nèi)注射腺病毒載體轉(zhuǎn)染PPAR-γ1到腦的方法可行,且對(duì)缺血再灌注腦具有保護(hù)作用。
　　 2.腦室內(nèi)轉(zhuǎn)染PPAR-γ1基因和PPAR-γ激活劑吡格列酮合用,能增強(qiáng)對(duì)I/R腦的保護(hù)作用。
　　 3.PPAR-γ1可以減少缺血再灌注腦組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),同時(shí)抑制IL-1β、ICAM-1、Bax、MMP-9、AQP-4上調(diào),促進(jìn)Bcl-2上調(diào)。提示PPAR-γ1是通過(guò)調(diào)控炎性損傷路徑發(fā)