轉(zhuǎn)染Akt基因?qū)Υ笫笮募∪毖俟嘧p傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 研究轉(zhuǎn)染Akt(Protein kinaseB)基因?qū)Υ笫笤隗w心肌缺血/再灌注(I/R)損傷心肌的保護(hù)作用；觀察其對(duì)Bcl-2、Bax、casepase-3等Akt下游基因表達(dá)的影響，初步探討其保護(hù)作用可能的分子機(jī)制；同時(shí)檢測(cè)心肌線粒體及線粒體通透性轉(zhuǎn)換相關(guān)指標(biāo)，初步探討I/R損傷基因保護(hù)和I/R損傷線粒體保護(hù)途徑的相關(guān)作用。 方法: 以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為載體將綠色熒光蛋白(green f

2、luorescence protein，GFP)報(bào)告基因分別按轉(zhuǎn)染倍數(shù)(multiplicities of infection，MOI)1、3、5轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，48h后取心肌組織做快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。 40只大鼠隨機(jī)分為5組：Ⅰ組為假手術(shù)組(Sham組，n=8)：開胸，只穿線不結(jié)扎；Ⅱ組為心肌I/R模型組(I/R組，n=8)：心肌內(nèi)微量注射PBS溶液30μl，關(guān)胸后飼養(yǎng)，48h后制備I/R模型；Ⅲ組為轉(zhuǎn)

3、染Akt基因組(Akt組，n=8)：心肌內(nèi)注射總體積為30μl的質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物(Akt質(zhì)粒5μg，脂質(zhì)體15μg，PBS10μl)，關(guān)胸后飼養(yǎng)，48h后制備I/R模型。IV組為空載體組(Vechicle Control組，n=8)：心肌內(nèi)注射不Akt基因的脂質(zhì)體溶液30μl(脂質(zhì)體15μg，PBS 15μl)關(guān)胸后飼養(yǎng)，48h后制備I/R模型；V組為Akt組(Ad Block組，n=8)：心肌內(nèi)注射Akt基因與脂質(zhì)體及Akt抑制劑LY

4、294002(5umol/L)混合溶液30μl，關(guān)胸后飼養(yǎng)，48h后制備I/R模型。 所有動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈插管至左心室記錄HR、LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的變化；檢測(cè)心肌損傷指標(biāo)CK、LDH；TTC染色法測(cè)量心肌梗死面積；HE染色光鏡分析組織病理改變；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)；Western Blot方法檢測(cè)Akt、casepase-3、Cyt-c蛋白表達(dá)；新鮮心臟組織提取線粒體后，

5、應(yīng)用戊二醛固定后電鏡下觀察線粒體結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用分光光度法測(cè)定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放情況。 結(jié)果: 1.以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為載體將GFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，48h后鏡下可見綠色熒光蛋白表達(dá)； 2.Akt基因轉(zhuǎn)染至在體大鼠心肌，并成功建立大鼠在體I/R模型； 3.轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(Ⅳ組)和Akt抑制劑組(Ⅴ組)左室心功能(HR、LVS

6、P、LVEDP、±dp/dtmax)改善，心肌損傷生化指標(biāo)LDH、CK活性下降，心肌梗死面積縮小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：I/R模型組(Ⅱ組)與空載體組(Ⅳ組)間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.HE染色的光鏡觀察：轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(Ⅳ組)和Akt抑制劑組(Ⅴ組)出血、壞死等損傷性改變輕，形態(tài)大致正常。 5.假手術(shù)組(Ⅰ組)較其余各組凋亡心肌細(xì)胞明顯減少(P<0.0

7、5)；轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(Ⅳ組)和Akt抑制劑組(Ⅴ組)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降(P<0.05)；I/R模型組(Ⅱ組)與空載體組(Ⅳ組)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 6.假手術(shù)組(Ⅰ組)Bcl-2和Bax表達(dá)較其余各組減少(P<0.05)；轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(Ⅳ組)和Akt抑制劑組(Ⅴ組)Bcl-2表達(dá)上調(diào)而Bax表達(dá)下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

8、5)：而I/R.模型組(Ⅱ組)與空載體組(Ⅳ組)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 7.假手術(shù)組(Ⅰ組)中Akt蛋白表達(dá)較其余各組均減少(P<0.05)，轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(Ⅳ組)和Akt抑制劑組(Ⅴ組)Akt蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，I/R模型組(Ⅱ組)與空載體組(Ⅳ組)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 8.假手術(shù)組(Ⅰ組)胞漿中cascpasc-3、Cyc-c蛋白表達(dá)較其

9、余各組均降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(IV組)和Akt抑制劑組(V組)蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，I/R模型組(Ⅱ組)與空載體組(IV組)間蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。假手術(shù)組(Ⅰ組)線粒體中casepase-3、Cyc-c蛋白表達(dá)較其余各組均增加(P<0.05)，轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(IV組)和Akt抑制劑組(V組)蛋白表達(dá)增加(P<0.

10、05)，I/R模型組(Ⅱ組)與空載體組(IV組)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)； 9.假手術(shù)組(Ⅰ組)線粒體在540 nm處吸光度值顯著高于其它各組；轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)較I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(IV組)和Akt抑制劑組(V組)吸光度值增高(P<0.05);I/R模型組(Ⅱ組)和空載體組(IV組)比較吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 10.I/R模型組(Ⅱ組)、空載體組(IV組)和Akt抑制劑組(V組)

11、線粒體損傷較轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組>嚴(yán)重，表現(xiàn)出明顯的空泡變性，線粒體腫脹，線粒體脊膜破裂。轉(zhuǎn)染Akt基因組(Ⅲ組)則明顯減輕線粒體損傷程度，大部分線粒體結(jié)構(gòu)基本完整。 結(jié)論: 1.陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000可有效的將Akt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心?。?2.轉(zhuǎn)染Akt基因可使心肌梗死面積縮小，減輕心肌損傷，改善心臟功能。 3.Akt基因具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，促使Bcl-2表達(dá)增多，Bax表