SD大鼠骨髓造血干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染SD大鼠DC的研究.pdf

1、目的:研究SD大鼠骨髓造血干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)擴(kuò)增為樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的穩(wěn)定可靠的培養(yǎng)方法，并探討攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染該DC的效率和FasL蛋白的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)FasL基因在同種異體器官移植中誘導(dǎo)免疫耐受和保護(hù)移植物奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.SD大鼠骨髓造血干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)DC：無(wú)菌手術(shù)取出雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓，大鼠淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離出界面單核細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)

2、整細(xì)胞濃度在1.5×10<'9>/L左右，于50ml的培養(yǎng)瓶中加入10ml的細(xì)胞懸液，加入rr-GM-CSF和rr-IL-4于37.0℃、5％的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天半量換液并加rr-GM-CSF和rr-IL-4，培養(yǎng)兩周收集細(xì)胞鑒定。 2.攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染DC：使用不含抗生素，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)一周的細(xì)胞重鋪于六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×10<'5>，24小時(shí)后觀察，細(xì)胞適合

3、感染，按照MOI=10感染細(xì)胞，使用GFP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，感染24小時(shí)后，培養(yǎng)皿中添加1ml新鮮培養(yǎng)基，每隔一天加細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度和數(shù)量，添加病毒液后10天收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)和WB檢測(cè)。 結(jié)果: 1.SD大鼠骨髓分離出的單核細(xì)胞培養(yǎng)兩周后，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞表面分子的陽(yáng)性率MHC-Ⅱ?yàn)?8.02％、CD86為62.82％、OX62為85.66％，經(jīng)TNF-a刺激，陽(yáng)性率MH

4、C-Ⅱ?yàn)?3.41％、CD86為93.94％、OX62為94.10％；倒置顯微鏡及電鏡可見(jiàn)典型的DC形態(tài)；同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中能刺激初始T細(xì)胞進(jìn)行增殖。 2. 攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染DC192小時(shí)(8d)后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)熒光，240小時(shí)(10d)感染效率為100％；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)顯示以Cell的1.00％為參照，Cell+FasL Plasmid為167.03％：免疫印跡檢測(cè)

5、轉(zhuǎn)染后FasL蛋白的表達(dá)顯示以Cell的1.00％為參照，Cell+FasLPlasmid為34.15％。 結(jié)論:成功建立了SD大鼠骨髓造血干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)擴(kuò)增DC的培養(yǎng)方法，通過(guò)形態(tài)學(xué)、分子表面標(biāo)志和MIR等鑒定得到證實(shí)；攜帶FasL基因的重組慢病毒載體成功感染DC，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot證實(shí)感染的DC表達(dá)FasL明顯提高。為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)FasL基因在同種異體器官移植中誘導(dǎo)免疫耐受和保護(hù)移植物奠定了理論和實(shí)