血型A抗原模擬多肽的初步研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、血型A 抗原模擬多肽的篩選 目的:篩選血型A 抗原的模擬多肽。 方法:用血型A 抗體NaM87-1F6 對噬菌體隨機(jī)12 肽庫進(jìn)行三輪篩選，隨機(jī)挑選32個噬菌體克隆，經(jīng)噬菌體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、噬菌體微篩選鑒定噬菌體與抗體的結(jié)合力。測定特異性噬菌體DNA序列并推導(dǎo)其展示的多肽序列。凝集抑制試驗(yàn)檢測噬菌體展示多肽對血型A 抗原的模擬作用。 結(jié)果: 1．經(jīng)三輪

2、篩選和相應(yīng)的鑒定后得到7個抗A 抗體NaM87-1F6的特異性噬菌體克隆。 2．其中6 噬菌體（C5，22，23，26，27，31）展示的多肽序列為EYWYCGMNRTGC（將此多肽序列命名為P5，展示此多肽的噬菌體以C5為代表），另一噬菌體克隆C17 展示的多肽序列為QIWYERTLPFTF（將此多肽序列命名為P17）。 3．凝集抑制試驗(yàn)提示展示這兩個多肽的噬菌體可以抑制A 型紅細(xì)胞的凝集作用，陰性對照噬菌體原肽庫不能

3、抑制這種凝集作用。 結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，多肽EYWYCGMNRTGC，QIWYERTLPFTF 可以模擬血型A 抗原的表位。此兩種多肽具有建立新型診斷和親和濾除抗A 抗體方法的潛能。 第二部分、血型A 抗原模擬多肽的GST 融合表達(dá) 目的：構(gòu)建表達(dá)血型A 抗原模擬多肽的融合表達(dá)載體，鑒定融合表達(dá)蛋白模擬血型A抗原的能力。 方法：PCR 擴(kuò)增血型A 抗原模擬多肽(P5、P17)和谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶

4、（GST）編碼基因，并連接成P5-GST和P17-GST，雙酶切后重組入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b，構(gòu)建質(zhì)粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。通過酶切、測序鑒定重組子。以BL21(DE3)為表達(dá)菌，在IPTG 誘導(dǎo)下表達(dá)P5-GST和P17-GST 融合蛋白，Ni-NTA 柱純化蛋白。競爭ELISA 鑒定融合蛋白對噬菌體展示多肽抗原活性的模擬作用，紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)分析融合蛋白模擬血型A 抗原的能力。 結(jié)果

5、： 1．成功構(gòu)建P5、P17基因和GST基因融合后的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。 2．P5-GST和P17-GST基因在宿主菌中高效表達(dá)并得到純化。 3．P5-GST和P17-GST蛋白以濃度依賴的方式抑制A 型紅細(xì)胞的凝集作用。 結(jié)論：原核表達(dá)的多肽融合蛋白P5-GST和P17-GST 可模擬天然血型A 抗原，具有替代天然A 抗原用于發(fā)展新型抗A 抗體檢測方法和

6、濾除材料的潛能。 第三部分、模擬多肽融合蛋白檢測血型抗體初步研究 目的：探討多肽融合蛋白EYWYCGMNRTGC-GST和QIWYERTLPFTF-GST 在血型A抗體檢測中的應(yīng)用價(jià)值。 方法：收集多份健康獻(xiàn)血者血漿，試管凝集實(shí)驗(yàn)對血型抗體進(jìn)行ABO 定型，滴度測定； 用基于GST 融合表達(dá)多肽EYWYCGMNRTGC（P5-GST），QIWYERTLPFTF(P17-GST）的ELISA 方法檢測血型抗

7、體；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較ELISA 方法與經(jīng)典凝集試驗(yàn)檢測血型抗體的效能。 結(jié)果： 1．收集到120份健康獻(xiàn)血者血漿，其中90份為抗A 抗體陽性，30份抗A 抗體陰性。 2．基于P5-GST的ELISA 檢測血漿抗A 抗體實(shí)驗(yàn)受試者工作特性曲線的曲線下面積分別為0.873（P<0.001），ELISA 結(jié)果A 值與凝集試驗(yàn)抗體滴度間的Spearman 相關(guān)系數(shù)分別為0.728（P<0.001）?；赑5-GST的ELI