鞭毛蛋白FliC突變體作為HPV L2多肽抗原載體的初步研究.pdf

1、目前上市的以HPV主要衣殼蛋白L1為基礎(chǔ)的病毒樣顆粒(VLP)疫苗，主要誘發(fā)型別特異性中和抗體，僅可預(yù)防兩種高危型病毒(HPV16，HPV18)感染相關(guān)的約70％的宮頸癌，對(duì)其他高危型誘發(fā)的約30％的宮頸癌缺乏有效保護(hù)，且生產(chǎn)成本高。病毒次要衣殼蛋白L2N端區(qū)域（主要集中于aa.13-154區(qū)）含有多個(gè)交叉中和抗體表位，可誘發(fā)產(chǎn)生廣譜保護(hù)反應(yīng)，但L2N多肽及表位的免疫原性弱，因此增強(qiáng)L2N的免疫原性，可望提高L2N多肽疫苗的廣譜免疫保護(hù)

2、活性。
　　鞭毛蛋白可以通過(guò)TLR5通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)的成熟，與抗原蛋白融合后免疫，可顯著增強(qiáng)抗原特異的免疫反應(yīng)及體內(nèi)保護(hù)活性。流感病毒臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)鞭毛蛋白與HA1的胞外區(qū)融合蛋白雖可有效增強(qiáng)抗原的免疫原性，但個(gè)別受試者也出現(xiàn)了肌肉疼痛、發(fā)冷等不良反應(yīng)。研究表明降低鞭毛蛋白自身抗體水平可以顯著減少小鼠血清前炎性因子、血清轉(zhuǎn)氨酶等的產(chǎn)生。
　　鑒于HPV18 DNA在宮頸癌

3、中檢出率僅次于HPV16，且HPV18感染腫瘤死亡率是HPV16的2.4倍，因此本研究以HPV18 L2 N多肽作為抗原，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白FliC進(jìn)行改造，在保留鞭毛蛋白的保守區(qū)，特別是保留TLR5的識(shí)別區(qū)域（ND1及CD1）的基礎(chǔ)上，對(duì)可刺激產(chǎn)生鞭毛蛋白自身抗體的高變區(qū)(ND2+D3+CD2a+CD2b)進(jìn)行不同程度的刪除，獲得fliC突變體;然后以此為L(zhǎng)2N多肽抗原的載體，在大腸桿菌中表達(dá)獲得各種FliC突變體/HPV18

4、L2 N融合蛋白，然后對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出免疫刺激活性強(qiáng)且誘發(fā)鞭毛蛋白自身抗體水平低的FliC突變體，用于L2多肽蛋白疫苗的研究。
　　結(jié)果如下:
　　1.采用oveflapPCR方法分別獲得了fliC△D3（刪除D3）、fliC△D3CD2a（刪除D3+CD2a）及fliC△D2D3（刪除D2+D3）突變體基因，并將其克隆入pET22b表達(dá)載體，獲得了鞭毛蛋白突變基因的原核表達(dá)載體。然后將18 L2N(aa.13-15

5、4)基因插入至fliC突變體刪除區(qū)域，獲得pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18 L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N表達(dá)載體。
　　2.上述三種fliC突變體/18 L2N融合基因原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21，30℃，0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)表明三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白均主要以包涵體的形式表達(dá)。經(jīng)N

6、i-Sepharose層析、透析復(fù)性及Q-SepharoseHP層析（去除內(nèi)毒素）步驟，獲得三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白。SDS-PAGE分析顯示獲得純度均大于90％，鱟試劑凝膠法顯示純化蛋白的內(nèi)毒素含量均低于50 EU/mg; Native-PAGE顯示各融合蛋白均主要以單體形式存在。
　　3.取等摩爾量的三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白及18 L2N，小鼠皮下免疫三次，間隔兩周。ELISA結(jié)果顯示，第三次免

7、疫兩周后，三種FliC突變體/18 L2N融合蛋白免疫血清中FliC特異性抗體滴度均較18 L2N組的顯著升高，且FliC△D3/18 L2N免疫組免疫血清中FliC特異性抗體滴度顯著高于FliC△D3CD2a/18 L2N和FliC△D2D3/18 L2N免疫組。FliC△D2D3/18 L2N免疫組與FliC△D3CD2a/18 L2N免疫組小鼠血清中FliC特異性IgG抗體無(wú)顯著性差異。
　　4.體重變化觀察發(fā)現(xiàn)18 L2N

8、、FliC△D2D3/18 L2N、FliC△D3CD2a/18 L2N免疫組小鼠體重均上升，只有FliC△D3/18 L2N免疫組小鼠在初次免疫后第一天體重下降，到第四天時(shí)體重恢復(fù)至與其他三組小鼠體重相近的水平。
　　5.假病毒中和實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)liC△D2D3/18 L2N免疫組和FliC△D3/18 L2N免疫組的HPV18血清中和抗體滴度均顯著高于18 L2N免疫組。FliC△D3CD2a/18L2N免疫組中和抗體滴度較低，