玉米GSAT突變體作為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、耐抗生素和除草劑的篩選標(biāo)記基因在植物基因組和葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用。但因其存在的潛在生態(tài)安全和對人類健康的危害等問題,對于標(biāo)記基因的應(yīng)用一直頗受爭議。近年來,對轉(zhuǎn)基因是否安全等問題的討論一直爭論不休,加上政府監(jiān)管要求更加嚴(yán)格,迫切的需求一種安全的替代選擇系統(tǒng)。已發(fā)現(xiàn),細(xì)菌四吡咯分子合成的關(guān)鍵酶谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamate-1-semialdehydeaminotransferase,GSAT)的突變體耐

2、專一性抑制劑3-氨基-2,3-二氫苯甲酸(Gabaculine)。它可以作為植物基因組轉(zhuǎn)化的安全篩選標(biāo)記基因。為此,我們嘗試以玉米GSAT作為植物核基因組和葉綠體基因組篩選標(biāo)記,構(gòu)建相關(guān)載體,獲得以下主要結(jié)果:
　　1.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的玉米GSAT突變體基因(mGSATM),設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增片段酶切,插入pCAMBIA1301,取代GUS基因,構(gòu)建核遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體。
　　2.采用前人改進(jìn)的高離子濃度低pH

3、法,提取獲得了煙草葉綠體基因組DNA,電泳檢測表明葉綠體基因組DNA符合要求,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增葉綠體同源重組片段trnA和trnI,測序結(jié)果表明和公布的序列同源性達(dá)99％。
　　3.利用重疊PCR技術(shù),分別在葉綠體常用篩選標(biāo)記壯觀霉素抗性基因aadA和本實(shí)驗(yàn)安全篩選標(biāo)記基因mGSATM前插入葉綠體來源的啟動(dòng)子prrn,并將葉綠體來源的終止子psbA加在mGSATM基因后面。然后將葉綠體同源重組片段trnA、trnI分別插入兩端,構(gòu)建