Botryosphaeria dothidea突變體庫的構建和突變體篩選及T-DNA插入位點側翼序列分析.pdf

1、Botryosphaeria dothidea是重要的林果潰瘍病害病原，分布廣，危害重，寄主多樣。該病菌引起的病害在20多個國家均有報道，在我國引起的危害亦為嚴重。因此，明確病菌的致病機制對于有效防控林果潰瘍病具有重要意義。目前對于B.dothidea研究主要集中在形態(tài)分類、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性以及防治方法等方面，但對其致病的分子機制缺乏系統(tǒng)研究。突變體庫的建立和致病相關基因的分離和功能鑒定是深入解析病菌致病分子機理基礎，可為病害防控提

2、供理論依據(jù)。
　　本研究在已建立的農(nóng)桿菌介導（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）的遺傳轉(zhuǎn)化體系基礎上構建了B.dothidea突變體庫，得到1053個轉(zhuǎn)化子，通過繼代培養(yǎng)和PCR檢測證明T-DNA插入到B.dothidea基因組中。對突變體庫進行了系統(tǒng)的分析，篩選獲得了一些與該病菌生長發(fā)育及致病性相關的突變體，并進一步對部分突變菌株的T-DNA插入位點的右

3、翼序列進行了擴增和分析，研究結果如下：
　　（1）以野生型菌株B.dothidea SDAU11-126為對照，對526個轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、生長特性及致病性測定，篩選到8株突變體菌株：
　?、倬闘W-27在PDA上氣生菌絲致密但不茂盛，菌落淡黃色，其生長速率和致病性均最小，生長速率和致病性與野生型都有顯著差異且分別降低了28.64％和54.90%；
　?、诰闘W-22在PDA上氣生菌絲致密也不茂盛，菌落淡黃色，其生

4、長速率和致病性均不存在顯著差異；
　?、劬闘W-7在PDA上氣生菌絲疏松旺盛，菌落初為白色，后為灰褐色，生長速率和致病性與野生型均存在顯著差異且分別增長了27.60%和13.76%；
　?、芫闘W-31在PDA上氣生菌絲疏松茂盛，菌落乳白色，其生長速率和致病性與野生型均增強且存在顯著差異，分別提高了29.35%和15.65%；
　?、菥闘W-26在PDA上氣生菌絲致密但不茂盛，菌落乳白色，其生長速率較野生型存在顯

5、著差異且降低了24.43%，但其致病性與野生型不存在顯著差異；
　?、蘧闘W-64在PDA上氣生菌絲疏松不茂盛，菌落邊緣有水溶現(xiàn)象，菌落紅褐色，生長速率和致病性與野生型不存在顯著差異；
　　⑦菌株LW-100在PDA上氣生菌絲疏松不旺盛，菌落呈輪紋狀，紅褐色，生長速率和致病性與野生型不存在顯著差異；
　?、郘W-111在PDA上氣生菌絲疏松且茂盛，菌落呈同心輪紋狀、乳白色，生長速率與野生型存在顯著差異且增長了27.8

6、3%，但其致病性與野生型不存在顯著差異。
　　（2）通過hiTAIL-PCR技術對篩選得到的4個突變體菌株進行右側翼序列擴增，其突變體LW-27的右側翼序列大小為994bp，經(jīng)序列比對為甘油激酶（Glycerol kinase） 基因；LW-64的右側翼序列大小為1105bp，經(jīng)序列比對為GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）基因；LW-100的側翼序列大小為1097bp，