希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫的構(gòu)建、篩選及相關(guān)突變體基因的克隆.pdf

1、希金斯刺盤孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它屬于子囊菌亞門,是一種半活體營養(yǎng)型的病害真菌。本研究以希金斯刺盤孢Ch-1菌株為出發(fā)菌株,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得2000多個(gè)T-DNA隨機(jī)插入突變體,為進(jìn)一步研究病原菌的致病機(jī)理提供了必要的材料。通過對(duì)突變體進(jìn)行生物學(xué)特性分析,并以擬南芥為寄主植物做致病性測(cè)定,對(duì)突變體進(jìn)行了初步篩選并將其分類,其中,2株生長緩慢,菌落不能

2、均勻擴(kuò)展；4株致病性減弱；3株產(chǎn)孢缺陷,在PDA平皿上不能產(chǎn)生分生孢子；4株產(chǎn)孢量增多；2株可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生過敏性壞死；13株色素異常；2株菌落扇變；3株附著孢萌發(fā)異常。
　　 對(duì)突變體Pch-1E393和Pch-1C36進(jìn)行了深入詳細(xì)的研究。突變體Pch-1E393生長速度明顯減慢,菌絲粗壯稀疏,與Ch-1相比差異顯著,但對(duì)擬南芥的致病力與菌株Ch-1無顯著差異,此突變體在侵染過程中能產(chǎn)生正常的黑色附著孢并能產(chǎn)生初生菌絲和次生

3、菌絲。Southern雜交證實(shí)在Pch-1E393中T-DNA標(biāo)記為雙拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對(duì)突變體Pch-1E393中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列進(jìn)行克隆,經(jīng)過序列分析,表明T-DNA插入破壞的基因包含一個(gè)1432bp的完整開放閱讀框,包含三個(gè)內(nèi)含子、四個(gè)外顯子,編碼一個(gè)352個(gè)氨基酸的蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比(blsatp),發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的減

4、數(shù)分裂重組蛋白DMC1(meiotic recombination protein DMC1)具有高度同源相似性,相似度為86％,此蛋白在減數(shù)分裂過程中參與同源重組。
　　 突變體Pch-1C36菌落灰白色,菌落中間呈黑色并塌陷,與Ch-1的菌落形態(tài)差異明顯,但致病性、生長速度、孢子產(chǎn)量等其他生物特性與Ch-1無明顯差異。Southern雜交證實(shí)T-DNA標(biāo)記在Pch-1C36中為雙位點(diǎn)插入。采用反向PCR技術(shù)對(duì)突變體Pch-1

5、C36中T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA進(jìn)行克隆,經(jīng)過序列分析,表明T-DNA插入破壞的基因包含一個(gè)690bp的完整開放閱讀框,包含兩個(gè)內(nèi)含子、三個(gè)外顯子,編碼一個(gè)174個(gè)氨基酸的蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比(blsatp),發(fā)現(xiàn)該序列與endofibonuclease L-PSP(liver perchlofic acid-soluble protein)同源性最高,L-PSP是在老鼠中,第一個(gè)被鑒定為單鏈RNA