水稻OsMAP65家族t-DNA插入突變體的篩選及表型鑒定.pdf

1、微管(MT)是細(xì)胞骨架的主要組成元件之一，其基本組成單位是微管蛋白(tubulin)。微管具有動態(tài)不穩(wěn)定性，且參與細(xì)胞的許多生命活動過程。在微管結(jié)合蛋白(MAPs)的協(xié)助下，微管蛋白對非生物脅迫（高鹽、高滲、病害等）的耐受性發(fā)揮重要的作用，從而應(yīng)對各種各樣的細(xì)胞內(nèi)部和外部刺激。MAPs的異常表達或者錯誤修飾都有可能會導(dǎo)致微管產(chǎn)生紊亂的現(xiàn)象，并有可能導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如癌癥等。MAP65是一類植物所特有的微管結(jié)合蛋白。最近在擬南芥中的研

2、究表明，在鹽脅迫時敲除MAP65-1會導(dǎo)致微管解聚，而MAP65-1過表達則會增加耐鹽性。這些結(jié)果表明在植物遭受各種非生物脅迫時MAP65具有調(diào)控微管組織的重要作用。在植物中，對擬南芥AtMAP65家族的基因的研究已有相關(guān)報道，而對單子葉模式植物——水稻(Oryza sativa)的OsMAP65家族的基因的研究還是很缺乏。因此，開展水稻O.sMAP65家族T-DNA插入突變體的篩選對進一步研究水稻耐逆性的分子機理具有重要的生物學(xué)意義。

3、
　　本實驗主要開展了以下幾項研究工作:(1)通過半定量RT-PCR技術(shù)分析逆境脅迫下水稻OsMAP65家族成員在粳稻品種日本晴中不同部位的表達情況;(2)對水稻OsMAP65相關(guān)基因的T-DNA插入突變體進行純合突變體篩選及鑒定;(3)對篩選出的純合突變體的表型及農(nóng)藝性狀進行調(diào)查分析;(4)對OsMAP65-1的純合突變體map65-1的有斑的株系(HM-4)進行細(xì)胞死亡鑒定、接菌試驗及Tail-PCR分析。具體研究結(jié)果如下:<

4、br>　　(1)在高鹽和干旱脅迫下，水稻OsMAP65家族成員在粳稻品種日本晴中不同部位的表達情況均不相同。例如，OsMAP65-1在鹽處理和PEG6000處理后的表達情況不同，鹽處理0h時在水稻的地上部分不表達，但是處理后3h發(fā)生誘導(dǎo)表達，持續(xù)到6h，9h后表達量則持續(xù)降低;PEG6000處理時地上部分則不表達，而地下部分兩種處理時該基因則一直有表達，說明這些逆境脅迫處理對該基因都有影響。
　　(2)利用“雙引物法(LP+RP，

5、RP+RB)”和“三引物法(LP+RP+RB)”篩選鑒定從國外購買的水稻OsMAP65基因相關(guān)的11種T-DNA插入突變體。鑒定結(jié)果:有3個純合體突變體的株系，分別是map65-1，map65-3，map65-7;有4個雜合的突變體的株系，分別是map65-2,map65-6,map65-8,map65-10。
　　(3)T-DNA插入純合突變體map65-1和map65-3在苗期時和野生型粳稻Dongin相比，長勢較慢，植株矮小

6、;栽種大田后發(fā)現(xiàn)抽穗期的突變體和野生型相比，分蘗數(shù)多且株型緊湊;成熟期時突變體雖然有效穗數(shù)比野生型多，但是飽實率非常低，幾乎全是癟粒。此外，還發(fā)現(xiàn)OsMAP65-1的純合突變體map65-1有些株系從五葉期時植株葉片上就出現(xiàn)了紅褐色斑點，疑似類病斑，并一直持續(xù)到成熟期。
　　農(nóng)藝性狀鑒定結(jié)果表明:T-DNA插入純合突變體與野生型相比較，在分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、主莖穗長這些農(nóng)藝性狀上有極顯著提高;在二次枝梗數(shù)這個農(nóng)藝性狀方面有顯著下降;

7、而在株高、穗抽出度、穗粒數(shù)、劍葉長度、千粒重這幾個農(nóng)藝性狀方面有極顯著下降。在粒長、粒寬、粒厚和劍葉寬度方面沒有顯著差異。在莖節(jié)方面，T-DNA插入純合突變體與野生型相比較，除了第一莖節(jié)是顯著下降，其他全是極顯著下降。
　　(4)取OsMAP5-1的純合突變體map65-1有斑植株的葉片，進行NBT、DAB染色，證明該葉片的細(xì)胞發(fā)生死亡。同時，對該有斑植株進行接菌試驗，發(fā)現(xiàn)該有斑植株對白葉枯病菌生理小種P2(PXO86)有一定的抗