水稻T-DNA插入葉綠素缺失突變體篩選及側(cè)翼序列分離.pdf

1、本研究是在建立了水稻（Orza sativa）大規(guī)模T-DNA插入突變體庫(kù)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展的關(guān)于水稻葉綠素缺失突變體篩選工作。葉綠素缺失突變體是在篩選水稻T-DNA插入突變體過(guò)程中得到最多，也是性狀明確、最易判定的一類(lèi)突變體。由于該類(lèi)突變體葉綠體發(fā)育大多受到不同程度的影響，而造成光合作用的改變，因此這類(lèi)突變體不但是研究葉綠素合成與降解，而且也是研究光合作用的基礎(chǔ)材料。本研究通過(guò)對(duì)苗期葉綠素缺失突變體的篩選，在獲得葉綠素缺失突變的基礎(chǔ)上，開(kāi)

2、展了對(duì)突變體的鑒定以及T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分離的工作；并且在獲得側(cè)翼序列的基礎(chǔ)上，探討了T-DNA插入位點(diǎn)附近序列的結(jié)構(gòu)；最后，對(duì)T-DNA插入所標(biāo)記的基因做了預(yù)測(cè)和PCR共分離驗(yàn)證，確定了造成葉綠素缺失性狀的候選基因；為最終驗(yàn)證候選基因的生物學(xué)功能，試驗(yàn)并建立了互補(bǔ)轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)體系。本研究所獲得的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、通過(guò)對(duì)大約10，000份水稻品種日本晴（Japonica rice cv． Nipponbare）T

3、-DNA插入增強(qiáng)子捕獲突變體庫(kù)葉綠素缺失突變體的篩選，共得到430個(gè)葉綠素缺失突變株系，在對(duì)突變株系GUS染色后，共檢測(cè)到34個(gè)GUS表達(dá)為陽(yáng)性的株系，并且9個(gè)株系的突變表型與GUS染色共分離。 2、利用PCR-walking技術(shù)分離了突變株的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。分離過(guò)程中分別使用了DraI、EcoRV、SspI限制性?xún)?nèi)切酶，在9個(gè)突變株系中共擴(kuò)增獲得10條序列，其中在株系A(chǔ)401中擴(kuò)得2條序列，其它株系各1條。經(jīng)過(guò)對(duì)所

4、獲得序列測(cè)序，在10個(gè)序列中，6個(gè)序列包含水稻基因組DNA，另外4個(gè)序列可能由于T-DNA左邊界通讀或者不明原因的測(cè)序終止，而不包含水稻序列，全部為增強(qiáng)子捕獲載體（pFX-E24．2-15R）的載體骨架。 3、通過(guò)對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)左側(cè)側(cè)翼序列的分析發(fā)現(xiàn)，在10個(gè)序列中，有8個(gè)序列獲得了關(guān)于T-DNA左邊界附近序列的信息，其它2個(gè)由于沒(méi)有測(cè)至LB，而沒(méi)有得到相關(guān)信息。在這8個(gè)序列中，7個(gè)都發(fā)生了T-DNA左邊界整合過(guò)程中不同程

5、度的的缺失現(xiàn)象，其中1個(gè)缺失程度甚至達(dá)到了130bp。除T-DNA左邊界序列缺失現(xiàn)象外，還發(fā)現(xiàn)2例不明來(lái)源序列的填充現(xiàn)象。另外常見(jiàn)的邊界通讀和T-DNA多拷貝重復(fù)現(xiàn)象也在本研究中發(fā)現(xiàn)。 4、經(jīng)過(guò)同源性搜索，6個(gè)含水稻基因組DNA的序列中，有4個(gè)位于基因的內(nèi)部，其余2個(gè)位于基因間。之后經(jīng)過(guò)PCR共分離驗(yàn)證，在被T-DNA插入標(biāo)記的4個(gè)基因中，確定3個(gè)基因與突變表型共分離，這3個(gè)基因分別是：被預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物定位于葉綠體的GTP-bin

6、ding基因，該基因編碼產(chǎn)物可能參與葉綠體核糖體組裝；編碼產(chǎn)物定位于線(xiàn)粒體的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）基因，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶參與光呼吸途徑；編碼產(chǎn)物定位于葉綠體的鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）基因，該酶參與葉綠體內(nèi)清除超氧陰離子的水-水循環(huán)過(guò)程。 5、通過(guò)對(duì)SOD基因的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，建立了以G418為篩選劑的互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因體系，這一轉(zhuǎn)化體系雖然與以潮霉素作為篩選劑的轉(zhuǎn)化體系比較其篩選效率相差甚遠(yuǎn)，但是通過(guò)大量轉(zhuǎn)化應(yīng)該能夠滿(mǎn)足互補(bǔ)