水稻T-DNA插入突變體的構(gòu)建及同源染色體配對(duì)基因PAIR3的分離與鑒定.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，也是禾谷類(lèi)作物功能基因組研究的模式植物。突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一，因此構(gòu)建水稻大型突變體庫(kù)是在全基因組水平上大規(guī)模、全面、系統(tǒng)的研究基因功能的重要技術(shù)平臺(tái)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化因其在水稻基因組中相對(duì)隨機(jī)的分布規(guī)律，高效的轉(zhuǎn)化體系，穩(wěn)定的后代遺傳及簡(jiǎn)單的遺傳背景，被廣泛的用于水稻突變體庫(kù)的構(gòu)建。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA隨機(jī)插入構(gòu)建突變體庫(kù)，在正常栽培條件下種植T1代分離群體，目測(cè)篩選

2、有明顯突變表型的家系并進(jìn)行突變表型與T-DNA純合插入共分離的檢測(cè)，并針對(duì)共分離家系，分離克隆相應(yīng)基因并進(jìn)行其功能分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．創(chuàng)建獨(dú)立T-DNA轉(zhuǎn)化單株30，579株。
　　 2．篩選9，193個(gè)突變家系，觀察到有突變表型的家系1，417個(gè)，突變率為15.4％，得到3個(gè)共分離家系：03211UG73，03211UL95，03211UF78。突變性狀分別為：白化苗，半矮，完全不育。對(duì)03211UF7

3、8進(jìn)行詳細(xì)的突變表型分析并分離克隆相應(yīng)基因PAIR3。
　　 3.03Z11UF78家系分離出的不育突變體命名為pair3-1。相對(duì)于分離出的野生型單株，其突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段及花序，花的發(fā)育都沒(méi)有任何差別；但在開(kāi)花時(shí)，突變體的花藥不外露，至成熟時(shí)，突變體完全不育。KI-I2溶液染色顯示突變體的花粉粒幾乎全不著色，表明突變體雄性不育。野生型花藥做父本，pair3-1做母本，雜交不結(jié)實(shí)，表明突變體雌性也不育。
　　 4.0

4、3Z11UF78家系的T1代及T2代共分離檢測(cè)顯示完全不育的性狀與T-DNA純合插入完全共分離。
　　 5．從本室突變體庫(kù)中得到等位突變體05211HE71，命名為pair3-2，突變性狀也是完全不育，T1代共分離檢測(cè)也是完全共分離。
　　 6．轉(zhuǎn)雙鏈RNAi載體的轉(zhuǎn)化單株育性明顯降低，35％（21/60）單株為完全不育。部分單株取RNA做半定量PCR分析顯示：轉(zhuǎn)基因單株的育性與PAIR3基因的表達(dá)相對(duì)應(yīng)。
　　

5、 7． RT-PCR及RACE確定PAIR3的基因序列。PAIR3基因在TIGR中編號(hào)為L(zhǎng)OC_Os10g26560，基因全長(zhǎng)為6，930bp（轉(zhuǎn)錄起始至終止），全長(zhǎng)cDNA為2，963bp，由11個(gè)外顯子及10個(gè)內(nèi)含子組成，編碼一個(gè)包含844個(gè)氨基酸的蛋白。BLASTN分析顯示PAIR3基因是一個(gè)新基因，在已完成基因組測(cè)序的物種中沒(méi)有找到同源基因或蛋白?；蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)只有一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
　　 8．花藥半薄切片

6、顯示：相對(duì)于野生型花藥的發(fā)育，pair3花粉囊壁的發(fā)育沒(méi)有受到影響；花粉母細(xì)胞的發(fā)育及其隨后的小孢子也沒(méi)有明顯變化；但在花粉有絲分裂時(shí)期至成熟花粉時(shí)期，花粉粒皺褶、干癟，沒(méi)有活力。
　　 9．胚囊石蠟切片顯示：相對(duì)于野生型胚囊的發(fā)育，pair3胚囊在功能大孢子形成時(shí)期出現(xiàn)異常，大孢子減數(shù)分裂后靠近合點(diǎn)端的大孢子不是變大形成功能大孢子，而是隨著另三個(gè)靠近珠孔端的大孢子相繼降解而降解。最終突變體胚珠中沒(méi)有胚囊的結(jié)構(gòu)，只見(jiàn)一些珠心組織

7、降解的痕跡。
　　 10．花粉壓片染色觀察突變體的減數(shù)分裂過(guò)程。結(jié)果顯示：pair3在終變期可見(jiàn)24條染色單體及后期Ⅰ染色體隨機(jī)分離。我們推測(cè)PAIR3基因通過(guò)影響水稻同源染色體的配對(duì)，造成性母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的隨機(jī)分離，從而導(dǎo)致pair3雌雄性都不育。
　　 11．半定量PCR分析顯示：PAIR3基因在稻穗中有表達(dá)，在莖、葉、葉鞘等營(yíng)養(yǎng)器官中不表達(dá)或很低水平的表達(dá)，這與突變體在營(yíng)養(yǎng)階段沒(méi)有表型而只造成雌雄都不育相對(duì)

8、應(yīng)；PAIR3基因在突變體（pair3-1和pair3-2）中都不表達(dá)，表明兩個(gè)等位突變體都是功能缺失（loss-of-function）的突變體；PAIR3基因在不同長(zhǎng)度的穗子中都有表達(dá)，但是表達(dá)趨勢(shì)是先上升再下降，在穗長(zhǎng)為4.5cm至11cm時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，而這時(shí)正是性母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期。
　　 12．原位雜交結(jié)果顯示：PAIR3基因在花藥早期的花粉囊壁細(xì)胞及孢原細(xì)胞中有微弱表達(dá)，隨后在小孢子母細(xì)胞、四分體、剛游離出的小孢子中高

9、表達(dá)，在小孢子中表達(dá)慢慢降低至液泡化大孢子期完全不表達(dá)，之后又特異的在降解中的絨氈層中表達(dá)；PAIR3基因在胚囊早期的孢原細(xì)胞及珠被原基中有微弱表達(dá)，隨后在整個(gè)胚珠、珠柄、子房?jī)?nèi)壁中表達(dá)，但主要是在大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)或剛完成時(shí)表達(dá)最強(qiáng)。因此PAIR3基因主要是在減數(shù)分裂時(shí)期的性母細(xì)胞中高表達(dá)，表明．PAIR3在減數(shù)分裂中起作用。PAIR3表達(dá)模式與突變表型相對(duì)應(yīng)。
　　 13．目前水稻中已報(bào)道的影響減數(shù)分裂的5個(gè)基因（PAI