黃瓜遺傳轉化體系優(yōu)化及T-DNA插入突變體創(chuàng)制.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是首個完成基因組測序的園藝作物，這使得黃瓜功能基因組學研究成為重點。功能基因組學研究最直接有效地方法之一是構建基因突變體庫，通過研究突變體來分離基因、鑒定基因功能。插入突變是植物突變體庫構建的重要手段，隨著農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化技術的日益成熟和T-DNA插入位點鑒定方法的豐富完善，T-DNA插入已經(jīng)成功用于多種植物插入突變體庫構建的研究中。創(chuàng)制黃瓜T-DNA插入突變體對于研究黃瓜基因功能具有重要

2、意義，也為葫蘆科其他作物功能基因組學研究提供有力參考。
　　T-DNA插入是在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化的基礎上實現(xiàn)的，而黃瓜遺傳轉化主要采用農(nóng)桿菌介導法。因此，建立高效穩(wěn)定的黃瓜遺傳轉化體系是創(chuàng)制黃瓜T-DNA插入突變體的前提條件。影響黃瓜遺傳轉化效率的因素有基因型、外植體類型、培養(yǎng)基成分、菌株及載體類型、茵液濃度、侵染時間、預培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間和篩選壓力等，其中培養(yǎng)基成分主要包括:無機營養(yǎng)物、有機營養(yǎng)成分、生長調節(jié)物質、固化劑和其他添

3、加劑等。目前，黃瓜遺傳轉化效率還較低。研究人員從生長調節(jié)物質、培養(yǎng)條件和篩選壓力等方面對黃瓜遺傳轉化體系優(yōu)化開展了大量的研究，但在固化劑、抗氧化劑和有機添加物等方面研究較少。本研究從培養(yǎng)基成分入手，通過改變培養(yǎng)基固化劑、添加抗氧化劑和有機添加物的方式，對農(nóng)桿菌介導的黃瓜遺傳轉化體系進行優(yōu)化，提高了遺傳轉化效率。在此基礎上，以植物突變體構建常用表達載體pROK2為T-DNA插入突變載體轉化黃瓜，并獲得了插入突變體，為構建黃瓜插入突變體庫、

4、研究黃瓜基因功能奠定重要基礎。具體研究內容及結果如下:
　　1.農(nóng)桿菌介導的黃瓜遺傳轉化體系優(yōu)化
　　在實驗室已經(jīng)建立的黃瓜遺傳轉化體系的基礎上，通過Kan敏感試驗，確定黃瓜栽培品種‘長春密刺’抗性芽的最適篩選壓力為100 mg/L。通過改變培養(yǎng)基固化劑、添加抗氧化劑和有機添加物的方式，對農(nóng)桿菌介導的黃瓜遺傳轉化體系進行優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)在脫乙酰吉蘭糖膠為固化劑的培養(yǎng)基上‘長春密刺’的抗性芽誘導率比以瓊脂粉為固化劑的培養(yǎng)基誘導率

5、高28.21％;共培養(yǎng)基中添加50 mg/L抗氧化劑α-LA時，‘長春密刺’抗性芽誘導率最高達66.67％，平均芽分化數(shù)最高達1.32;在選擇培養(yǎng)基中添加1.5 g/L的有機添加物CH，‘長春密刺’抗性芽誘導率和平均芽分化數(shù)最高，分別為67.15％和1.42。綜上，本研究得到了以脫乙酰吉蘭糖膠為培養(yǎng)基固化劑，共培養(yǎng)基中添加50 mg/Lα-LA或選擇培養(yǎng)基中添加1.5 g/L CH的優(yōu)化的遺傳轉化體系，外植體抗性芽誘導高于實驗室之前的研

6、究44.40％。
　　2.黃瓜T-DNA插入突變體的創(chuàng)制
　　以黃瓜栽培品種‘長春密刺’子葉節(jié)為轉化外植體，采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法，用T-DNA插入突變載體pROK2轉化黃瓜;使用PCR和斑點雜交方法鑒定T0和T1代轉化植株;以‘長春密刺’未轉化植株為對照，調查統(tǒng)計T1代植株的表型。T0代PCR檢測結果初步證明了14S1、14S2兩個株系均整合了35S啟動子和NPT-Ⅱ基因序列;T1代PCR檢測結果顯示14S1自

7、交后代55個單株中12個單株均擴增出了35S和NPT-Ⅱ片段;以Dig標記的35S和NPT-Ⅱ為探針對這12個單株及隨機選取剩余單株中的11株進行斑點雜交檢測，得到14S1-27和14S1-34兩個單株有35s和NPT-Ⅱ雜交信號;性狀調查統(tǒng)計顯示，T1代植株表型與對照植株沒有明顯的差異。綜合結果表明pROK2重組質粒成功整合到了14S1株系的基因組中，對14S1自交后代的PCR檢測和斑點雜交檢測進一步證明了14S1為轉化植株，確定14