尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及部分致病相關(guān)突變體插入位點(diǎn)的定位.pdf

1、香蕉枯萎病是一種系統(tǒng)性維管束病害,用化學(xué)農(nóng)藥很難防治,又因?yàn)槠鋫鞑ト菀浊宜俣瓤?給香蕉種植業(yè)帶來毀滅性打擊。本研究首先從海南省不同市縣采集不同地理來源的香蕉枯萎病菌4號(hào)小種,通過經(jīng)典病理學(xué)與分子生物學(xué)的方法對(duì)這些香蕉枯萎病的病原進(jìn)行了鑒定;經(jīng)過致病性測(cè)定后發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株致病性方面存在差異,并從中篩選出致病性強(qiáng)且生長旺盛的菌株193-6作為插入突變的原始野生型菌株。在進(jìn)行突變體庫的構(gòu)建之前,優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的該生理小種的轉(zhuǎn)化體系,優(yōu)化

2、后4號(hào)生理小種的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到700-800個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)香蕉枯萎病菌孢子。PCR驗(yàn)證表明外源的T-DNA已經(jīng)成功地整合到病原菌基因組中。應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體系已建立了包含2520個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體庫,并且已經(jīng)完成了所有轉(zhuǎn)化子的單孢分離、致病性測(cè)定以及部分致病性變化顯著突變體的側(cè)翼序列克隆工作。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1、從海南省不同市縣采集到具有香蕉枯萎病癥狀的香蕉假莖材料,分離純化得到17株香蕉枯萎病菌,經(jīng)顯微觀察、分子檢測(cè)以及

3、柯赫法則鑒定后確定17株病原菌均為香蕉枯萎病菌,其中10株為香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種菌株,7株為1號(hào)生理小種。從這些4號(hào)生理小種菌株中挑取致病力和生活力都較強(qiáng)的單孢菌株193-6,用作T-DNA插入遺傳轉(zhuǎn)化的野生型菌株。
　　 2、大規(guī)模構(gòu)建突變體庫前,對(duì)ATMT轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率非常高。優(yōu)化后的最佳條件分別是:誘導(dǎo)劑AS的濃度為150μmol/mL,AS誘導(dǎo)前IM培養(yǎng)基中的農(nóng)桿菌濃度OD600為0.1

4、5,農(nóng)桿菌經(jīng)IM液體培養(yǎng)基AS誘導(dǎo)的時(shí)間為7個(gè)小時(shí),Focr4孢子濃度為1×107個(gè)/mL,培養(yǎng)溫度為25℃,誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值為5.5,共培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
　　 3、通過潮霉素抗性篩選,獲得抗性遺傳穩(wěn)定的突變菌株2520個(gè),本實(shí)驗(yàn)對(duì)2520個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了單孢分離及致病力的檢測(cè)。
　　 4、通過致病性測(cè)定方法的摸索,找到了首先離體葉片粗篩,組培苗復(fù)篩,大田實(shí)驗(yàn)最后確認(rèn)突變體致病性變化的高通量突變體致病性測(cè)定方法。