大麗輪枝菌Vd991 T-DNA插入突變體庫(kù)的構(gòu)建及致病相關(guān)基因的篩選.pdf

1、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是棉花黃萎病的病原菌。近年來(lái),黃萎病在我國(guó)南北方棉區(qū)發(fā)展蔓延迅速,危害也在逐年加重,已成為當(dāng)前制約我國(guó)棉花生產(chǎn)的突出問(wèn)題。常規(guī)育種方法和其它防治方法如物理化學(xué)方法等在黃萎病的防治中收效甚微。目前對(duì)大麗輪枝菌的致病機(jī)理知之甚少,且缺乏可資利用的高抗抗源材料,因此,對(duì)于棉花黃萎病的研究應(yīng)不僅僅包括挖掘高抗抗源材料和選育抗病品種,還應(yīng)找出大麗輪枝菌關(guān)鍵的致病相關(guān)基因。本研究通過(guò)

2、T-DNA插入突變與功能基因鑒定等方法,構(gòu)建大麗輪枝菌Vd991 T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù),篩選與鑒定Vd991的致病相關(guān)基因,旨在為研究大麗輪枝菌致病分子機(jī)理和棉花黃萎病的防治提供理論依據(jù)和手段。
　　 構(gòu)建了含有構(gòu)巢曲霉TrpC啟動(dòng)子和潮霉素基因的真菌表達(dá)載體pCTHyg,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系將pCTHyg上的T-DNA轉(zhuǎn)入Vd991的基因組中,得到15131個(gè)Vd991 T-DNA隨機(jī)插入突變體。對(duì)其中30株

3、突變體在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力、產(chǎn)孢能力和在不同類型棉種中致病力的差異等表型特征進(jìn)行鑒定,并對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明:
　　 1.T-DNA插入突變會(huì)導(dǎo)致突變體在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力發(fā)生改變。從突變體在PDA、查比克、纖維素-查比克(纖維素為唯一碳源)和果膠-查比克(果膠為唯一碳源)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)果可以看出:與野生型Vd991相比,突變體92G09在查比克培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率下降；76E01和92G

4、09在以纖維素和果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率下降。
　　 2.T-DNA插入突變會(huì)導(dǎo)致突變體的產(chǎn)孢能力發(fā)生改變。與野生型Vd991相比,突變體76B11、76E01、78A12、78C02、78C07-2和92B12在查比克液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢能力明顯下降。
　　 3.T-DNA插入突變會(huì)導(dǎo)致突變體的致病力發(fā)生改變。與野生型Vd991相比,部分被測(cè)突變體的致病力明顯下降；
　　 (1)突變體424、68E02

5、、76E01、77D01、77F07、78C05、78C07-1、78C07-2、91D08、91H07和92A03對(duì)感病棉種冀11的致病力明顯下降,低于野生型Vd991致病力的1／3;
　　 (2)突變體424、68E02、76E01、77C09、77D01、78C02、78C07-2、91F03、92A03、92B12、92D02和92E07對(duì)耐病棉種豫21的致病力明顯下降,低于野生型Vd991致病力的1／3；
　　

6、 (3)突變體76A12、76E01、77806、77F07、77H02、78A12、78C07-2、85H04、91F03、91H07和92A12對(duì)抗病棉種魯28的致病力明顯下降,低于野生型Vd991致病力的1／3；
　　 (4)突變體424、68E02、76E01、77D01、78C07-2和91D08對(duì)不同參試棉花品種的致病力均由強(qiáng)變?nèi)?78C03對(duì)不同參試棉花品種的致病力均由強(qiáng)變中。
　　 4.hiTAIL-PC