淡紫紫孢菌T-DNA插入體庫(kù)的構(gòu)建和致病相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum(Thom)Samson)是一種典型的土壤及多種植物根系的習(xí)居菌，不僅可以寄生植物線蟲的卵，而且還可以毒殺植物線蟲幼蟲。除此之外，淡紫紫孢菌還可以降解農(nóng)藥，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本論文主要以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，建立淡紫紫孢菌T-DNA插入突變體庫(kù)，通過(guò)對(duì)突變體表型變化的研究，篩選出對(duì)線蟲卵及幼蟲毒力變化的突變菌株?？寺》治隽薢n(Ⅱ)2Cys6轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和磷脂酶D基因與淡

2、紫紫孢菌侵染和殺死線蟲的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)篩選出抗草丁膦基因bar和抗萎銹靈基因CBX,作為抗性標(biāo)記，構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)淡紫紫孢菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。其轉(zhuǎn)化條件為:抗性基因?yàn)榫幋a抗草丁膦基因bar和抗萎銹靈基因CBX,淡紫紫孢菌Pl36-1孢子濃度為106孢子/mL，根癌農(nóng)桿菌AGL-1的OD600值為0.2，共培養(yǎng)溫度為25℃，共培養(yǎng)時(shí)間為54小時(shí)，乙酰丁香酮AS濃度為250μg/mL，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm/min

3、。通過(guò)對(duì)絲核菌531菌株、擬松材線蟲幼蟲、根結(jié)線蟲卵或幼蟲等毒力測(cè)定，篩選出了359株表型變異的菌株。對(duì)突變體表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)淡紫紫孢菌存在豐富的有益基因資源。
　　(2)通過(guò)對(duì)耐不同濃度多菌靈的淡紫紫孢菌突變菌株β-tubulin基因克隆和突變位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-tubulin基因第145(S)，185(T)和200(F)氨基酸同時(shí)分別突變?yōu)锳，A和Y時(shí)，淡紫紫孢菌耐多菌靈的濃度從0.3μg/mL提高到100μg/mL。生物學(xué)特

4、性和致病性測(cè)定等試驗(yàn)表明β-tubulin基因位點(diǎn)的改變不會(huì)影響淡紫紫孢菌形態(tài)學(xué)特征和對(duì)線蟲的毒力。同時(shí)大田試驗(yàn)結(jié)果表明β-tubulin基因具有穩(wěn)定的抗性遺傳，可以作為有效的選擇標(biāo)記基因。
　　(3)白灰制菌素對(duì)線蟲幼蟲致死有明顯的作用。通過(guò)對(duì)弱毒力菌株R147的T-DNA插入位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)Zn(Ⅱ)2Cys6轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白rolP基因正向調(diào)控淡紫紫孢菌白灰制菌素A的合成，而對(duì)白灰制菌素B的合成有負(fù)調(diào)控作用。該基因在侵染線蟲的早期過(guò)

5、程中上調(diào)表達(dá)。rolP基因的表達(dá)受營(yíng)養(yǎng)條件或環(huán)境因子的影響。當(dāng)乳糖為碳源（或L-丙氨酸為氮源）時(shí)，mRNA相對(duì)表達(dá)量最高;同時(shí)pH值試驗(yàn)表明酸性環(huán)境更適合rolP基因表達(dá)。
　　(4)以弱毒力菌株pt386為材料發(fā)現(xiàn)磷脂酶D不僅對(duì)線蟲卵寄生有一定作用，而且對(duì)線蟲幼蟲致死也有重要作用。當(dāng)磷脂酶D基因pld插入失活，導(dǎo)致淡紫紫孢菌對(duì)線蟲的毒力減弱。克隆測(cè)序表明該基因含有兩個(gè)HKD保守結(jié)構(gòu)域。該基因主要在侵染線蟲早期起降解線蟲卵或幼蟲表

6、皮及細(xì)胞等作用。當(dāng)碳源為麥芽糖或氮源為L(zhǎng)-丙氨酸時(shí)，有利于pld基因的表達(dá)。同時(shí)，酸性環(huán)境(pH4-6)及溫度在27-29℃時(shí)，pld基因的表達(dá)水平提高。
　　(5)白灰制菌素D雖然對(duì)線蟲毒殺作用不顯著，但是對(duì)核盤菌有很強(qiáng)的拮抗抑制作用。通過(guò)對(duì)菌株pt361研究發(fā)現(xiàn)編碼糖苷水解酶31的基因PGH31對(duì)白灰制菌素D有調(diào)控作用。室內(nèi)及大田試驗(yàn)表明，淡紫紫孢菌菌株對(duì)核盤菌有抑制效果，同時(shí)可以促進(jìn)油菜增產(chǎn)，是一種防治核盤菌的潛力生防因子。