灰葡萄孢T-DNA插入突變菌株的致病性分析.pdf

1、灰霉病是一種由灰葡萄孢引起的世界性重要病害,灰葡萄孢寄主范圍廣,可侵染多種經(jīng)濟(jì)作物、觀賞性植物,并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失?；移咸焰咧饕跃z、菌核、孢子形式在病殘?bào)w或者土壤中越冬。由于灰葡萄孢繁殖快、遺傳變異大、適合度高,使其防治一直難以解決。目前國(guó)內(nèi)外仍主要采取化學(xué)農(nóng)藥,輔以生物及生態(tài)、農(nóng)業(yè)等多種措施防治灰霉病。
　　 本研究從前期獲得的400余株灰葡萄孢.ATMT轉(zhuǎn)化子中篩選到一株致病突變菌株BCG-183,經(jīng)活化培養(yǎng),從形態(tài)學(xué)水

2、平對(duì)該菌株進(jìn)行了表型分析,發(fā)現(xiàn)該菌株菌絲產(chǎn)量較野生型明顯增大；在PDA平板上培養(yǎng)7 d后,菌落呈白色,明顯區(qū)別于野生型菌株的灰色菌落,不產(chǎn)生分生孢子。將野生型菌株BC-22和突變菌株BCG-183分別接種到經(jīng)表面消毒的番茄葉片和果實(shí)上,保濕培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)突變菌株形成的病斑面積明顯大于野生型菌株,說(shuō)明突變菌株致病力較野生型明顯增強(qiáng)。突變菌株在產(chǎn)胞壁降解酶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6 d,利用DNS法測(cè)定酶活,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的胞壁降解酶酶活性強(qiáng)于野生型。

3、將黃瓜種子和番茄種子在突變菌株和野生型菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)濾液浸泡1d后,于含有濕潤(rùn)濾紙的保濕培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5 d發(fā)現(xiàn)突變菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)濾液浸泡過(guò)的黃瓜和番茄種子萌發(fā)率顯著下降；提取突變菌株和野生型菌株的粗毒素,將等量粗毒素接種于番茄葉片上,發(fā)現(xiàn)突變菌株粗毒素形成的病斑面積較野生型大,突變菌株的產(chǎn)酸能力較野生型明顯增強(qiáng)。
　　 本文利用CTAB法提取突變菌株BCG-183的基因組DNA,利用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增該菌株的T-DNA插入位點(diǎn)

4、側(cè)翼序列,從分子水平確定T-DNA插入位點(diǎn)。對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點(diǎn)為灰葡萄孢基因組超級(jí)重疊群42(Supercontig42)中假定蛋白編碼基因(BC1G_07455)的3’末端,破壞了該基因的表達(dá)。BC1G07455基因的cDNA全長(zhǎng)1221bp,編碼了406個(gè)氨基酸殘基的假定蛋白,該蛋白與馬爾尼菲青霉菌的水楊酸羥化酶、曲霉屬的FAD依賴(lài)氧化還原酶、黃萎病菌的犬尿氨酸3-單加氧酶KMO(kynurenine3