紅色紅曲霉T-DNA插入突變庫的構(gòu)建及GABA代謝相關(guān)基因的克隆.pdf

1、紅曲霉（Monascus）作為我國重要的微生物資源，已經(jīng)有著上千年的應(yīng)用歷史。其在生長過程中能產(chǎn)生紅曲色素、γ-氨基丁酸（丫-Aminobutyric Acid，GABA）、MonacolinK、固醇、異黃酮、不飽和脂肪酸、蛋白酶等多種生理活性物質(zhì)。GABA作為紅曲霉多種代謝產(chǎn)物之一，具有抵抗焦慮、降低血壓、改善腦部機(jī)能、促進(jìn)生長激素分泌、活化肝功能、腎功能等作用，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子。幾年前，紅曲霉的研究主要集中在菌種分類

2、選育、活性成分分離純化及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化等方面，近年來，分子生物學(xué)的研究也逐漸起步，但很多尚處于探索和建立方法的階段，對紅曲霉的遺傳背景知識了解很少，對GABA代謝相關(guān)基因的研究工作更是鮮見報道。
　　 本研究以實(shí)驗室保存的紅色紅曲霉（Monascus ruber）菌種Mr-5為實(shí)驗材料，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅色紅曲霉的高效轉(zhuǎn)化體系，通過形態(tài)觀察及顯微特征分析，篩選獲得了一批形態(tài)特征變化明顯的轉(zhuǎn)化子，并初步研究了其主要代謝產(chǎn)物。

3、在此基礎(chǔ)上，采用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增了部分轉(zhuǎn)化子T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅色紅曲霉T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過對根癌農(nóng)桿菌濃度、紅色紅曲霉培養(yǎng)時間、紅色紅曲霉分生孢子液濃度、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)濃度、根癌農(nóng)桿菌與紅色紅曲霉的共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)膜類型等轉(zhuǎn)化因素的優(yōu)化，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅色紅曲霉的高效轉(zhuǎn)化體系

4、:紅色紅曲霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d后收集孢子，制備紅色紅曲霉孢子懸浮液，濃度為106孢子/mL，根癌農(nóng)桿菌濃度OD600為0.5，誘導(dǎo)劑AS濃度為100μmol/L，根癌農(nóng)桿菌與紅色紅曲霉在硝酸纖維素膜(NC膜)上25℃共培養(yǎng)3d。采用此體系成功構(gòu)建了含有1300多個紅色紅曲霉轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入突變體庫。
　　 2、轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性分析、PCR鑒定及形態(tài)觀察
　　 將1300多株紅色紅曲霉轉(zhuǎn)化子接種于PDA培

5、養(yǎng)基，隨機(jī)挑選50株轉(zhuǎn)化子接種到不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7d。連續(xù)轉(zhuǎn)接6次后，再轉(zhuǎn)接到含200μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，同時接種出發(fā)菌株Mr-5作為對照，30℃培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，計算其穩(wěn)定性。同時提取基因組DNA進(jìn)行潮霉素抗性基因PCR鑒定。結(jié)果顯示，上述轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性高達(dá)98％，并且轉(zhuǎn)化子菌株的基因組中均有T-DNA插入。
　　 將1300多株紅色紅曲霉轉(zhuǎn)化子菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，30℃

6、培養(yǎng)7d，進(jìn)行菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察。結(jié)果表明，大部分轉(zhuǎn)化子與原始菌株差別不大，只有少數(shù)轉(zhuǎn)化子在菌落顏色、菌落隆起、生長速度、氣生菌絲、菌絲表面附著物、分生孢子形狀、閉囊殼數(shù)量及形態(tài)等方面發(fā)生了較大變化。
　　 3、轉(zhuǎn)化子的主要代謝產(chǎn)物分析
　　 采用紙層析、UV-VIS、TLC等方法測定了突變體庫中紅色紅曲霉轉(zhuǎn)化子的GABA、色價和桔霉素含量，結(jié)果顯示，與原始菌株相比，轉(zhuǎn)化子菌株產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力發(fā)生了不同程度的變化。G

7、ABA方面，14株代表性轉(zhuǎn)化子菌株中有13株的GABA產(chǎn)量有明顯高于原始菌株Mr-5，其中Mr-5-50的產(chǎn)量達(dá)到3.161g/L，約為Mr-5的4.37倍;色價方面，4株轉(zhuǎn)化子菌株在505nm處的色價明顯升高，其中Mr-5-155高達(dá)106.5 U/mL，是Mr-5色價33.27 U/mL的3.2倍;2株轉(zhuǎn)化子菌株的色價明顯降低，其中Mr-5-33菌株的色價僅為7.48 U/mL，只有Mr-5的0.22倍。同時，部分轉(zhuǎn)化子菌株在300

8、-600 nm的吸收波長也發(fā)生了不同程度的變化，如Mr-5-7、Mr-5-35、Mr-5-38、Mr-5-54、Mr-5-59、Mr-5-97、Mr-5-155均有三個吸收峰，Mr-5-46和Mr-5-50均只有390-400 nm左右的一個吸收峰，Mr-5-158吸收峰不明顯，而原始菌株Mr-5有兩個吸收峰。桔霉素方面，5株轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液中的桔霉素含量有所降低，其中Mr-5-50的桔霉素含量未檢測出，可能低于TLC方法能夠檢測的最低

9、值0.2μg/g。
　　 4、轉(zhuǎn)化子側(cè)翼序列擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析
　　 采用TAIL-PCR技術(shù)對14株紅色紅曲霉GABA轉(zhuǎn)化子菌株T-DNA插入位點(diǎn)的右臂側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，成功獲得了轉(zhuǎn)化子Mr-5-72的T-DNA右側(cè)序列，命名為gabaX-72，大小為405 bp，對其氨基酸序列進(jìn)行了同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其與構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）FGSC A4的假定蛋白AN7090.2有98％相似性。綜合研