盾殼霉T-DNA插入體庫(kù)的構(gòu)建及兩個(gè)分生孢子形成相關(guān)基因的克隆.pdf

1、盾殼霉(Coniothyriumminitans)是植物病原真菌核盤菌(Sclerotinia.sclerotiorum)的重要生防真菌。本研究以ZS-1菌株為出發(fā)菌株，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化盾殼霉的技術(shù)體系及克隆相關(guān)基因的技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建了含30500個(gè)轉(zhuǎn)化子的T-DNA標(biāo)記插入轉(zhuǎn)化子庫(kù)，克隆到2個(gè)與產(chǎn)孢相關(guān)的基因，現(xiàn)報(bào)道如下： 對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了高效轉(zhuǎn)化盾殼霉的技術(shù)體系。發(fā)現(xiàn)ZS-1菌株的培養(yǎng)時(shí)間、用于轉(zhuǎn)化的

2、分生孢子濃度、分生孢子與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時(shí)間等與轉(zhuǎn)化效率有關(guān)。當(dāng)使用在PDA斜面上培養(yǎng)21d所獲得的分生孢子(濃度為108個(gè)孢子/ml)與細(xì)菌共培養(yǎng)96h后獲得的轉(zhuǎn)化效率最高，每皿可以獲得500個(gè)轉(zhuǎn)化子。建立了以熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)、反向PCR(iPCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、cDNA文庫(kù)等為基礎(chǔ)的克隆基因的技術(shù)平臺(tái)，并利用此技術(shù)平臺(tái)克隆了產(chǎn)孢相關(guān)的基因。 利用上述轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建了盾殼霉ZS-1菌株的T-

3、DNA插入體庫(kù)，獲得了30500個(gè)轉(zhuǎn)化子。自盾殼霉的插入突變體庫(kù)中共篩選得到了127株產(chǎn)孢缺陷型突變體，其中65株突變體在PDA平皿上不能產(chǎn)生分生孢子，而另外的62株則可以產(chǎn)生少量的孢子。這些產(chǎn)孢缺陷型突變體在菌絲生長(zhǎng)速度、產(chǎn)抗生物質(zhì)、寄生菌核能力和菌落形態(tài)等方面存在差異顯著性，大多數(shù)突變體的T-DNA為單位點(diǎn)插入，且插入位點(diǎn)不同。這即表明盾殼霉的分生孢子形成復(fù)雜，受多種基因調(diào)控。依據(jù)菌落形態(tài)，65株完全不產(chǎn)孢的突變體大致可分為7種類型

4、，即I類：突變體生長(zhǎng)緩慢，菌落不能均勻擴(kuò)展，共26株；II類：突變體生長(zhǎng)較緩慢，氣生菌絲茂盛，共28株；Ⅲ類：突變體生長(zhǎng)正常，但菌落中央的菌絲塌陷，潰解，僅1株：IV類：突變體生長(zhǎng)正常，但與寄主(核盤菌)接觸后可以恢復(fù)產(chǎn)孢能力，共3株；V類：菌絲生長(zhǎng)塊，甚至超過(guò)出發(fā)菌株ZS-1，共5株；VI類：生長(zhǎng)緩慢，菌絲稀疏，菌落中有菌絲集結(jié)，呈鐵銹色，僅1株；VII類：突變體只能產(chǎn)生分生孢子器而不產(chǎn)生分生孢子，僅1株；另外還有11株菌落形態(tài)上沒(méi)有

5、明顯的區(qū)別，沒(méi)有具體的歸為哪一類。 對(duì)產(chǎn)孢缺陷型突變體ZS-1T2029進(jìn)行了詳細(xì)的研究。突變體ZS-1T2029在菌絲生長(zhǎng)和分泌抗生物質(zhì)等方面與出發(fā)菌株ZS-1相比沒(méi)有顯著差異；此突變體仍具寄生核盤菌的能力，在菌核上可以產(chǎn)生分生孢子，但其寄生腐爛菌核的能力顯著下降，顯微觀察發(fā)現(xiàn)ZS-1T2029的分生孢子形成停滯于分生孢子器原基階段。Southern雜交證實(shí)T-DNA標(biāo)記在ZS-1T2029中為單位點(diǎn)插入。證實(shí)T-DNA插入破

6、壞了精氨酸特異性氨甲酰磷酸合成酶基因(CMCMPS1)，CMCPS1的cDNA全長(zhǎng)為3900bp，編碼含1170個(gè)氨基酸的蛋白。Southern雜交分析表明CMCPS1在盾殼霉ZS-1菌株中為單拷貝，Northern雜交顯示在ZS-1T2029中沒(méi)有檢測(cè)到CMCPS1的mRNA，采用RNAi技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CMCPS1與盾殼霉孢子形成相關(guān)。在PDA培養(yǎng)基中添加精氨酸或瓜氨酸可以恢復(fù)ZS-1T2029產(chǎn)孢試驗(yàn)表明T-DNA插入破壞CMCPS

7、1導(dǎo)致不能合成精氨酸是ZS-1T2029不能產(chǎn)孢的原因。因此，精氨酸與盾殼霉分生孢子形成相關(guān)。在PDA培養(yǎng)基中添加一氧化氮供體硝普鈉(SNP)可恢復(fù)ZS-1T2029產(chǎn)孢，而在PDA中添加一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)可以抑制ZS-1菌株產(chǎn)生分生孢子，試驗(yàn)結(jié)果表明精氨酸通過(guò)一氧化氮調(diào)控盾殼霉的分生孢子形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：一氧化氮在分生孢子器原基及分生孢子器中有大量的積累，而在菌絲中累積不明顯；在PDB

8、培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，在ZS-1和ZS1-T2029中均可以產(chǎn)生NO，其釋放量在第3d達(dá)到最高，但后者NO的產(chǎn)量顯著下降。 對(duì)產(chǎn)孢缺陷型突變體ZS-1T21882進(jìn)行研究。ZS-1T21882在菌絲生長(zhǎng)、寄生能力和分泌抗生物質(zhì)等方面與出發(fā)菌株ZS-1相比沒(méi)有顯著差異。突變體與核盤菌菌落接觸的地方及其菌核上均能夠產(chǎn)生分生孢子，但在液體振蕩培養(yǎng)時(shí)僅能形成分生孢子器原基。Southern雜交證實(shí)T-DNA標(biāo)記在ZS-1T21882中為單拷

9、貝插入。對(duì)ZS-1T21882中T-DNA插入破壞的基因進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA克隆，證實(shí)T-DNA插入破壞了谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶基因(CMAMPRS1)；CMAMPRS1的全長(zhǎng)cDNA為1749bp，含一個(gè)1560bp的完整閱讀框架(ORF)，該ORF編碼含583個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。CMAYPRS1在盾殼霉基因組中為單拷貝，RT-PCR結(jié)果顯示此基因在突變體ZS-1T21882中不表達(dá)，而在出發(fā)菌株ZS-1中有表達(dá)。谷氨酰胺磷酸核糖