盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因的克隆及液體產(chǎn)孢條件的優(yōu)化.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是重要的植物病原真菌,給油菜、向日葵等作物的生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌的重寄生真菌,是作物菌核病的重要生防菌。本文對(duì)T-DNA標(biāo)記插入突變產(chǎn)孢缺陷型菌株ZS-1T16229中相關(guān)基因進(jìn)行了部分克隆及序列分析,并對(duì)ZS-1菌株在液體振蕩培養(yǎng)下促進(jìn)產(chǎn)孢的條件進(jìn)行了探討,結(jié)果如下:
　　 從盾殼霉ZS-1菌株T-DNA

2、標(biāo)記插入突變體庫中篩選出的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢缺陷型突變株ZS-1T16229,以之為材料,采用TAIL-PCR技術(shù)對(duì)T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)右側(cè)的基因組DNA2進(jìn)行了克隆,獲得了大小為1131bp的DNA片段；對(duì)該基因組DNA片段進(jìn)行了序列分析,并利用GenScan軟件進(jìn)行了閱讀框(ORF)預(yù)測(cè),結(jié)果表明該DNA片段中可能含有一個(gè)不完整的閱讀框(324-1100nt),編碼259aa。對(duì)推定蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了同源性比較(Blastp),發(fā)

3、現(xiàn)該蛋白含有保守的Pex2-Pex12結(jié)構(gòu)域,與真菌的過氧化物酶體蛋白PEX2有極高的同源性,如與煙曲霉(Aspergillus fumigatus Af293)的PEX2相同部位等同的氨基酸為59％,類似的氨基酸達(dá)74％。命名該基因?yàn)镃MPEX2,證實(shí)T-DNA標(biāo)記在ZS-1T16229中為單拷貝插入,破壞CMPEX2的后半部分。PEX2參與真菌的活性氧代謝,消解活性氧的毒害作用。研究發(fā)現(xiàn),與出發(fā)菌株相比,突變體ZS-1T16229偏

4、向于培養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng),推定與緩解活性氧對(duì)菌體毒害作用有關(guān),CMPEX2基因可能與ZS-1T16229的產(chǎn)孢缺陷型等表型相關(guān)。
　　 探討了在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中添加少量瓊脂粉(0.1‰-1.5‰w/v)對(duì)盾殼霉ZS-1菌株的生物產(chǎn)量及產(chǎn)孢的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn),在PDB添加不同量的瓊脂粉對(duì)ZS-1菌株的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢均有顯著的促進(jìn)作用。命名該液體培養(yǎng)基為PDB-1a,其中當(dāng)瓊脂粉的添加量為0.75‰時(shí),綜合效果最為理想

5、,在此條件下,于100 ml PDB中培養(yǎng)10d ZS-1菌株的生物產(chǎn)量達(dá)616.1±6.2mg,孢子產(chǎn)量為(6.1±0.1)×109個(gè)/100 ml PDB-1a,與對(duì)照(PDB)相比,生物產(chǎn)量提高了40.4％,孢子產(chǎn)量提高了260.9％。
　　 以含0.75‰瓊脂粉的PDB-1a為培養(yǎng)液,研究了ZS-1菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢時(shí)間動(dòng)態(tài)、接種量和裝液量對(duì)產(chǎn)孢的影響,并以瓊脂粉的添加量、接種量和培養(yǎng)時(shí)間為影響因子,進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)

6、行了分析。發(fā)現(xiàn)ZS-1菌株生長(zhǎng)速度加快,生物產(chǎn)量及產(chǎn)孢于第8d達(dá)到高峰,而對(duì)照中于第11d生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢的高峰期,縮短3d；裝液量對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均有顯著影響,其中于250 ml三角瓶中添加100 mlPDB-1a,菌株的生物產(chǎn)量達(dá)614.5±9.3mg,產(chǎn)孢達(dá)(6.2±0.2)×109個(gè)/100 mlPDB-1a。接種量對(duì)菌株的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢有顯著的影響,其中最佳接種量是6 ml孢子懸液/100 ml PDB-1a(孢子懸液的濃度為107

7、孢子/ml PDB),此時(shí),生物產(chǎn)量為619.1±10.8g,產(chǎn)孢量為(6.2±0.1)×109個(gè)/100 ml PDB-1a。正交分析發(fā)現(xiàn),在含0.75‰瓊脂粉的PDB-1a為培養(yǎng)液、接種量為6 ml孢子懸液/100 mlPDB-1a(孢子懸液的濃度為107孢子/ml PDB)、培養(yǎng)時(shí)間為8d的綜合條件下液體振蕩培養(yǎng),菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最好。
　　 研究發(fā)現(xiàn)0.75‰PDB-1a對(duì)盾殼霉其它2個(gè)能在液體振蕩培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢的菌株(C

8、M37和CM38)的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢都有顯著的促進(jìn)作用；對(duì)在液體振蕩培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢的菌株Chy-1可以明顯促進(jìn)其生物產(chǎn)量的提高,但不能促使其產(chǎn)孢,表明PDB中添加少量的瓊脂粉從本質(zhì)上不能誘導(dǎo)盾殼霉產(chǎn)孢。研究還發(fā)現(xiàn)PDB-1a對(duì)草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、木霉(Trichoderma spp)和禾谷鐮孢菌(Fusarium.graminearum)等4種絲孢綱真菌