硼抑制煙草疫霉產(chǎn)孢的相關(guān)機(jī)制及該菌csn4基因的轉(zhuǎn)錄特征.pdf

1、煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）是卵菌綱的一種土傳植物病原菌，廣泛存在于溫帶、亞熱帶和熱帶，可侵染包括煙草、番茄、柑橘、杏等90多個(gè)科250多個(gè)屬的1000多種植物。煙草疫霉破壞性極強(qiáng)，由其引起的病害嚴(yán)重危害著作物的生長(zhǎng)和生理，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，因而是一種備受關(guān)注的土傳植物病原菌。然而，目前尚無(wú)有效的方法來(lái)控制這種土傳病害的傳播。研究發(fā)現(xiàn)煙草疫霉產(chǎn)孢子囊和釋放游動(dòng)孢子是導(dǎo)致寄主病害發(fā)生與流行的主要原

2、因。因此加強(qiáng)煙草疫霉孢子囊產(chǎn)生及游動(dòng)孢子釋放機(jī)制的研究，減少和控制煙草疫霉產(chǎn)生孢子囊，對(duì)防控?zé)煵菀呙共『Πl(fā)生具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mM硼極顯著抑制煙草疫霉孢子囊的產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)硼在抑制煙草疫霉產(chǎn)孢子囊時(shí)顯著抑制了一個(gè)與致病疫霉基因組測(cè)序推導(dǎo)的COP9信號(hào)復(fù)合體CSN4亞基同源的基因表達(dá)，然而其抑制機(jī)理并不清楚。為此本文分析研究了煙草疫霉抗氧化系統(tǒng)和csn4基因?qū)ε鹨种频捻憫?yīng)，以及csn4基因在煙草疫霉不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期

3、的轉(zhuǎn)錄特征，結(jié)果表明硼顯著改變了煙草疫霉的抗氧化系統(tǒng)，csn4基因轉(zhuǎn)錄量在煙草疫霉產(chǎn)孢子囊時(shí)期顯著高于其它時(shí)期，添加硼處理會(huì)顯著抑制煙草疫霉產(chǎn)孢子囊時(shí)期 csn4基因的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果證明了COP9信號(hào)復(fù)合體CSN4亞基與煙草疫霉產(chǎn)孢子囊有關(guān)，為控制煙草疫霉孢子囊的產(chǎn)生提供理論基礎(chǔ)。
　　主要取得了如下研究結(jié)果：
　?。?）硼對(duì)煙草疫霉產(chǎn)孢期抗氧化系統(tǒng)影響的研究結(jié)果表明，硼處理組煙草疫霉產(chǎn)孢期的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化

4、氫酶（CAT）活性顯著（P＜0.05）低于無(wú)硼處理，相反，所有硼處理組均使得丙二醛（MDA）含量增加，而 MDA作為細(xì)胞氧化的終產(chǎn)物，其含量的升高說(shuō)明活性氧積累，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜合分析表明硼脅迫使得菌體抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而不能正常發(fā)育。
　?。?）通過(guò)對(duì)引物等的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)建立了 csn4基因的相對(duì)定量方法。采用beta-tubulin基因作為內(nèi)參基因，分別對(duì)兩基因的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)并篩選，最終各獲得

5、一對(duì)特異性良好的引物，并分別構(gòu)建了兩基因的重組質(zhì)粒，最終建立了csn4和beta-tubulin基因的實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程分別為y=-4.007x+26.889、y=-4.109x+28.453，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9976、0.9936。采用 Ecsn4/Etub的值（Ecsn4和Etub分別表示csn4和beta-tubulin基因的轉(zhuǎn)錄量）來(lái)表示csn4基因的轉(zhuǎn)錄水平，此方法有效的消除了不同處理樣品模板量差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果的影響，并且本研究證明了該定量方法的可行性。
　?。?）不同濃度硼處理下煙草疫霉產(chǎn)孢期csn4基因轉(zhuǎn)錄的定量分析結(jié)果表明，硼處理組煙草疫霉產(chǎn)孢期csn4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于無(wú)硼處理，且低濃度的硼處理（0.5 mM）就可顯著抑制csn4基因的轉(zhuǎn)錄，其抑制率達(dá)到40％左右，隨硼濃度的變化，csn4基因轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。
　?。?）對(duì)煙草疫霉不同時(shí)期csn4基因轉(zhuǎn)錄的定量分析結(jié)果顯示，煙草疫霉從菌絲生長(zhǎng)階段到產(chǎn)孢階段，csn4

7、基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，且誘導(dǎo)產(chǎn)孢階段以及游動(dòng)孢子釋放階段csn4基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于菌絲生長(zhǎng)及游動(dòng)孢子階段。煙草疫霉csn4基因不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平大小順序?yàn)椋寒a(chǎn)孢階段＞游動(dòng)孢子釋放＞菌絲生長(zhǎng)＞游動(dòng)孢子階段。在誘導(dǎo)產(chǎn)孢階段中，隨誘導(dǎo)產(chǎn)孢時(shí)間的延長(zhǎng)，csn4基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，當(dāng)誘導(dǎo)12 h時(shí)達(dá)到最高水平，相當(dāng)于菌絲生長(zhǎng)階段csn4基因轉(zhuǎn)錄量的4倍左右。綜合以上結(jié)果表明，csn4基因參與煙草疫霉的整個(gè)生命過(guò)程，但主要參與煙草疫霉的發(fā)育產(chǎn)