粉紅螺旋聚孢霉67-1菌寄生相關(guān)基因的篩選與功能研究.pdf

1、粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea，又名粉紅粘帚霉Gliocladium roseum）是一類重要的菌寄生真菌，可以防治核盤菌、灰葡萄孢、鐮刀菌、立枯絲核菌等引起的多種植物真菌病害，同時還可以促進作物生長，在溫室和田間試驗中廣泛應(yīng)用，具有巨大的生防潛力。但目前尚未見該菌寄生核盤菌菌核分子機制的報道。為闡明粉紅螺旋聚孢霉寄生菌核機制，篩選菌寄生相關(guān)基因，本研究以實驗室前期分離得到的一株高效粉紅螺旋聚孢霉菌株67-1為材料

2、，通過高通量測序技術(shù)分別獲得了67-1全基因組序列和寄生核盤菌菌核轉(zhuǎn)錄組信息，并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、幾丁質(zhì)酶基因chi67和單加氧酶基因mono67在寄生菌核過程中的作用。
　　本研究以67-1菌絲為材料，提取基因組DNA后進行全基因組測序和分析。首先構(gòu)建了三個PE文庫（170 bp，300 bp和500 bp）和1個MP文庫(5kb)，采用Illumina Hiseq2500平臺進行測序，測序覆蓋度大于150×，對

3、序列進行組裝后共得到1，552個contigs（重疊群），N50為99，664bp。這些contigs繼續(xù)組裝形成475個scaffolds，N50為569，489 bp。最終組裝信息表明，67-1基因組大小為55.4 Mb，G+C含量為49.2％。通過Fgenesh軟件分析，共預(yù)測出20，747個基因，與NCBI NR數(shù)據(jù)庫比對，共有13，474個找到同源序列。67-1基因組序列信息為后續(xù)研究其與植物病原真菌的互作提供分子基礎(chǔ)。

4、>　　為研究粉紅螺旋聚孢霉67-1寄生核盤菌菌核分子機制并篩選寄生相關(guān)基因，本研究利用高通量測序和實時熒光定量PCR技術(shù)篩選獲得了67-1寄生核盤菌菌核不同時間間隔(8h、24 h和48 h)的差異表達基因。轉(zhuǎn)錄組測序和分析表明共得到26，351個單值基因，其中有18，525個基因可以注釋到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG數(shù)據(jù)庫。在3個寄生時間段分別有3，217、4，025和4，274個基因上調(diào)表達，2，739、1，2

5、49和1，064個基因下調(diào)表達。對差異表達基因進行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)菌核誘導(dǎo)下12個基因明顯上調(diào)表達，與轉(zhuǎn)錄組分析一致，為研究粉紅螺旋聚孢霉寄生相關(guān)基因提供候選基因。
　　內(nèi)參基因是應(yīng)用實時熒光定量PCR精確檢測基因表達量的基礎(chǔ)。為了篩選67-1寄生菌核過程中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，本研究選擇了7個真菌常用的管家基因，18S核糖體蛋白基因(18S rRNA)肌動蛋白基因（Actin），β-微管蛋白基因（β-tubulin），

6、延伸因子基因(Elongation factor)，泛素基因（Ubiquitin），泛素結(jié)合蛋白基因（Ubiquitin-conjugating enzyme）和甘油3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），通過geNorm、Bestkeeper和Normfmder三個常用內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)延伸因子基因表達在不同階段均最為穩(wěn)定，可以用于67-1寄生核盤菌

7、菌核相關(guān)基因的定量。
　　本文通過67-1寄生菌核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到一個編碼脂滴包被蛋白的基因per3、一個幾丁質(zhì)酶基因chi67和一個單加氧酶基因mono67，這三個基因均在菌核誘導(dǎo)下顯著上調(diào)表達。通過全基因組信息獲得3個基因全長DNA序列。分別對per3和chi67過表達，發(fā)現(xiàn)突變菌株對菌核的寄生能力顯著提高，16 h達到100％。防治大豆菌核病溫室盆栽試驗表明，per3轉(zhuǎn)化子6-4防治大豆菌核病效果最好，達到76.5％，比

8、野生菌株和多菌靈分別高23.8％和20.9％。這是脂滴包被蛋白在菌寄生菌中首次作為生防因子的報道。chi67轉(zhuǎn)化子在16h時對菌核寄生力比野生菌株高130％，對大豆菌核病防效分別比野生菌株和多菌靈高31.7％和28.7％，且產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力是野生菌株的2.4倍。對mono67基因進行敲除驗證，利用同源重組原理構(gòu)建了mono67敲除載體，并成功獲得了敲除突變株△mono67。室內(nèi)和溫室生測表明，△mono67對核盤菌菌核的侵染起始時間與野生