大豆再生相關(guān)基因GmLEC1的克隆及其功能初步分析.pdf

1、大豆是我國(guó)重要的糧食和油料作物，但大豆生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)需求，因此急需加快大豆分子育種步伐。但是大豆分子育種的發(fā)展深受大豆再生體系建立難、遺傳轉(zhuǎn)化效率低的阻礙。大豆再生體系的建立應(yīng)先清楚與大豆再生相關(guān)的關(guān)鍵基因功能及其作用機(jī)理，才能為最終建立高效、穩(wěn)定的大豆再生體奠定基礎(chǔ)。
　　AtLEC1在體細(xì)胞胚胎發(fā)育的過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)同源克隆方法從大豆中獲得GmLEC1基因，并通過(guò)生物信息學(xué)等相關(guān)技術(shù)手段對(duì)該基因核苷

2、酸序列以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、親水性和疏水性及進(jìn)化樹(shù)等進(jìn)行分析，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化大豆及擬南芥進(jìn)行再生基因的功能初步驗(yàn)證，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)本研究利用同源克隆技術(shù)通過(guò)對(duì)擬南芥再生相關(guān)基因LEC1進(jìn)行同源序列比對(duì)，從大豆中克隆LEC1基因兩個(gè)成員的全長(zhǎng)CDS序列，得到大豆再生相關(guān)基因GmLEC1-a，GmLEC1-b，GmLEC1-a編碼區(qū)長(zhǎng)度為672 bp，編碼223個(gè)氨基酸，GmLEC1-b編碼區(qū)長(zhǎng)度為681 bp，編碼226個(gè)氨

3、基酸。
　　(2)運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)大豆GmLEC1基因核苷酸序列以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、親水性和疏水性及進(jìn)化樹(shù)等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，GmLEC1蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白;通過(guò)對(duì)LEC1蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GmLEC1為H2A超家族成員，并與擬南芥屬植物親緣較近。
　　利用MEGA5軟件構(gòu)建大豆GmLEC1基因與其他物種LEC1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明大豆GmLEC1基因與擬南芥屬親緣關(guān)系較近。
　　(3)采用熒光定

4、量RT-PCR方法對(duì)GmLEC1-a基因的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明GmLEC1-a基因在未成熟種子中的表達(dá)量最高，其次是花。
　　(4)激素表達(dá)模式分析大豆GmLEC1-a基因受激素(GA3，6-BA，IAA，ABA)誘導(dǎo)情況，結(jié)果表明GmLEC1-a基因受這幾種激素的誘導(dǎo)。
　　(5)構(gòu)建了植物表達(dá)入門(mén)載體pGWC和植物表達(dá)載體pGWB5-GmLEC1-a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌，并通過(guò)與PCR相結(jié)合的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行

5、驗(yàn)證。
　　(6)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)采用花絮浸染法、子葉節(jié)法分別對(duì)擬南芥大豆進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并且通過(guò)PPT篩選和PCR鑒定的方法對(duì)過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行鑒定，將目的基因GmLEC1-a轉(zhuǎn)入植物體中并收獲種子，通過(guò)PPT篩選和PCR鑒定的方法對(duì)過(guò)表達(dá)植株后代進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用熒光成相儀對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆苗進(jìn)行熒光蛋白分析。
　　(7).當(dāng)在GmLEC1-a突變體和在野生型擬南芥過(guò)量表達(dá)該基因時(shí)，觀察表型可知，GmLEC1-a基因在擬南芥中的缺失表達(dá)