大豆再生相關基因GmLEC1的克隆及其功能初步分析.pdf

1、大豆是我國重要的糧食和油料作物，但大豆生產(chǎn)遠不能滿足國內(nèi)需求，因此急需加快大豆分子育種步伐。但是大豆分子育種的發(fā)展深受大豆再生體系建立難、遺傳轉(zhuǎn)化效率低的阻礙。大豆再生體系的建立應先清楚與大豆再生相關的關鍵基因功能及其作用機理，才能為最終建立高效、穩(wěn)定的大豆再生體奠定基礎。
　　AtLEC1在體細胞胚胎發(fā)育的過程中起著至關重要的調(diào)節(jié)作用，本研究通過同源克隆方法從大豆中獲得GmLEC1基因，并通過生物信息學等相關技術手段對該基因核苷

2、酸序列以及蛋白質(zhì)結構、親水性和疏水性及進化樹等進行分析，通過遺傳轉(zhuǎn)化大豆及擬南芥進行再生基因的功能初步驗證，主要實驗結果如下:
　　(1)本研究利用同源克隆技術通過對擬南芥再生相關基因LEC1進行同源序列比對，從大豆中克隆LEC1基因兩個成員的全長CDS序列，得到大豆再生相關基因GmLEC1-a，GmLEC1-b，GmLEC1-a編碼區(qū)長度為672 bp，編碼223個氨基酸，GmLEC1-b編碼區(qū)長度為681 bp，編碼226個氨

3、基酸。
　　(2)運用生物信息學方法對大豆GmLEC1基因核苷酸序列以及蛋白質(zhì)結構、親水性和疏水性及進化樹等進行分析。結果表明，GmLEC1蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白;通過對LEC1蛋白功能結構域進行分析發(fā)現(xiàn)，GmLEC1為H2A超家族成員，并與擬南芥屬植物親緣較近。
　　利用MEGA5軟件構建大豆GmLEC1基因與其他物種LEC1基因的系統(tǒng)進化樹，結果表明大豆GmLEC1基因與擬南芥屬親緣關系較近。
　　(3)采用熒光定

4、量RT-PCR方法對GmLEC1-a基因的組織特異性表達進行分析，結果表明GmLEC1-a基因在未成熟種子中的表達量最高，其次是花。
　　(4)激素表達模式分析大豆GmLEC1-a基因受激素(GA3，6-BA，IAA，ABA)誘導情況，結果表明GmLEC1-a基因受這幾種激素的誘導。
　　(5)構建了植物表達入門載體pGWC和植物表達載體pGWB5-GmLEC1-a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌，并通過與PCR相結合的方法對結果進行

5、驗證。
　　(6)通過農(nóng)桿菌介導采用花絮浸染法、子葉節(jié)法分別對擬南芥大豆進行遺傳轉(zhuǎn)化，并且通過PPT篩選和PCR鑒定的方法對過表達植株進行鑒定，將目的基因GmLEC1-a轉(zhuǎn)入植物體中并收獲種子，通過PPT篩選和PCR鑒定的方法對過表達植株后代進行檢測，同時用熒光成相儀對轉(zhuǎn)基因大豆苗進行熒光蛋白分析。
　　(7).當在GmLEC1-a突變體和在野生型擬南芥過量表達該基因時，觀察表型可知，GmLEC1-a基因在擬南芥中的缺失表達