大豆GmSOT1基因的克隆與功能研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.)]屬于豆科植物，為人類提供大量的食用蛋白質(zhì)，也為工業(yè)生產(chǎn)提供重要的原料，是重要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物。硫代葡萄糖苷（Glucosinolate，簡(jiǎn)稱硫苷）是一種存在于十字花科植物中含硫和氮的次生代謝產(chǎn)物，其水解產(chǎn)物具有抑制細(xì)菌、真菌增殖和抗蟲等功能。而磺酸基轉(zhuǎn)移酶(sulphotransferase，簡(jiǎn)稱SOT)是硫代葡萄糖苷（Glucosinolate，簡(jiǎn)稱硫苷）核心結(jié)構(gòu)合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，因而具有重

2、要的地位。
　　本研究采用反向遺傳學(xué)方法從大豆根系中提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到GmSOT1基因的編碼區(qū)（coding sequences，簡(jiǎn)稱CDS）由1014 bp的核苷酸組成，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為337個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。然后采用PCR方法擴(kuò)增大豆GmSOT1基因，并將其連接到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn)上，且命名為pCAMBIA2301-35S∶GmSOT1。而后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmSO

3、T1基因整合到大豆植物體中。運(yùn)用GUS染色和PCR方法篩選和檢測(cè)獲得了大豆轉(zhuǎn)基因植株。通過觀察表型，GmSOT1基因的過量表達(dá)和敲除后的轉(zhuǎn)基因植株在株型上都比對(duì)照更加矮小?；蚯贸蟮霓D(zhuǎn)基因大豆種子相對(duì)于對(duì)照粒小、顏色更深，并且種子兩端有明顯的白化現(xiàn)象。
　　為了研究GmSOT1基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位，本研究構(gòu)建了GmSOT1C端融合GFP的質(zhì)粒載體，通過煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)后，在激光共焦顯微鏡下觀測(cè)GmSOT1基因可能在細(xì)胞膜和

4、細(xì)胞核里行使其功能。
　　為了改良轉(zhuǎn)基因大豆生根體系，本研究分別在抗性大豆生根起始外植體、IBA濃度和生根預(yù)處理三個(gè)方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，帶胚軸外植體不定根誘導(dǎo)比不帶胚軸外植體的效率更高;IBA達(dá)到1.0 mg/L可以誘導(dǎo)出的根系更加健壯且移栽成活率高達(dá)74.88％;大豆不定根誘導(dǎo)外植體經(jīng)過預(yù)處理Ⅲ后，即:1/8 MSB5培養(yǎng)基培養(yǎng)5d，再轉(zhuǎn)入1/4 MSB5培養(yǎng)基培養(yǎng)5d，最后轉(zhuǎn)入1/2 MSB5+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)