煙草NtLEA1基因的克隆與功能研究.pdf

1、煙草 NtLEA1 基因的克隆與功能研究 重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文 （學(xué)術(shù)學(xué)位） 學(xué)生姓名：?；勖?指導(dǎo)教師：夏慶友 教 授 專 業(yè)：生物學(xué) 學(xué)科門類：理 學(xué) 重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 二 O 一三年四月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要 I 摘 要 胚乳后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein

2、s，LEA 蛋白）是一類在種子胚胎發(fā)育晚期豐富聚集的蛋白質(zhì)。LEA 蛋白是一類多家族蛋白，并在生物界廣泛分布。LEA 基因除在正常種子發(fā)育后期豐富表達(dá)外，高鹽、干旱和冷害等環(huán)境因素及脫落酸（ABA）等植物激素也可誘導(dǎo)一些 LEA 基因在葉片、根等植物營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)。研究表明，LEA 蛋白與植物抗逆密切相關(guān)，LEA 基因的過(guò)表達(dá)能提高受體植株的耐鹽、耐干旱能力。煙草作為一種重要的模式植物，普遍用于研究其他植物的 LEA 基因的功能，但其自

3、身的 LEA 基因的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。隨著煙草基因組測(cè)序工作的完成，挖掘信息，研究煙草 LEA 基因，探索其功能，對(duì)植物抗逆基礎(chǔ)研究領(lǐng)域具有重要意義，并有望通過(guò)遺傳育種手段提高煙草的抗旱耐鹽性。本研究結(jié)合生物信息學(xué)方法和分子克隆手段從煙草中克隆到一個(gè) LEA基因，命名為 NtLEA1，并通過(guò)生物信息學(xué)分析、逆境脅迫的表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因煙草植株表型分析，來(lái)初步探索 NtLEA1 基因的功能，主要工作內(nèi)容及成果如下： ① 結(jié)合生物信息學(xué)分析

4、方法，用番茄的 LEA 基因序列同源檢索煙草 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)，EST 序列拼接得到預(yù)測(cè)的煙草 LEA 基因，通過(guò)分子克隆獲得目的基因的ORF 編碼區(qū)序列，總長(zhǎng)度為 501bp，GC 含量為 51.5%，與番茄 LEA 基因序列相似度達(dá) 78%，命名為 NtLEA1 基因。該基因編碼 166 個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為 17.3551kD， 等電點(diǎn)為 8.62， 不穩(wěn)定系數(shù)為 15.71， 親水性總平均值為-1.103。保守結(jié)構(gòu)域

5、預(yù)測(cè) NtLEA1 蛋白含有 7 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的 11-氨基酸保守基序，屬于第三組 LEA 蛋白。生物信息學(xué)分析表明 NtLEA1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α 螺旋結(jié)構(gòu)為主，具有高親水性和熱穩(wěn)定性。 啟動(dòng)子序列分析表明 NtLEA1 基因上游序列中含 1 個(gè)胚乳表達(dá)元件（Skn-1 motif）、2 個(gè) ABA 應(yīng)答元件（ABRE）、1 個(gè) MeJA 響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、1 個(gè)水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、1 個(gè)高溫脅

6、迫應(yīng)答元件（HSE）、1 個(gè)干旱應(yīng)答元件（MBS）及 2 個(gè)光調(diào)控元件（Box 4）。 ② 半定量 PCR 分析表明 NtLEA1 基因的表達(dá)受 PEG 模擬干旱脅迫、ABA、鹽脅迫的誘導(dǎo)，幾乎不受冷脅迫的誘導(dǎo)，其中受鹽脅迫誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈，由此推斷NtLEA1 基因與煙草抗逆相關(guān)。 ③ 為進(jìn)一步探索 NtLEA1 基因的功能，本研究構(gòu)建了一個(gè)由 CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物雙元表達(dá)載體 pCXSN-NtLEA1，并由根瘤農(nóng)桿菌 LBA