煙草NtAAP2基因的克隆及功能研究.pdf

1、氨基酸是植物體內(nèi)至關(guān)重要的有機(jī)氮化合物，煙草葉片中氨基酸的含量不僅可以影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)影響烤煙的品質(zhì)和風(fēng)味。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。植物中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以劃分為APCs（the amino acid polyamine choline transporter）和ATFs（the amino acid transporter family）兩大家族，其中氨基酸透性酶（amino

2、 acid permease, AAPs）亞家族分屬于ATFs家族，目前植物中關(guān)于AAPs成員的研究較多。
　　本研究對(duì)煙草AAPs家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并從普通煙草（紅花大金元）中克隆得到了兩個(gè)NtAAP2基因，分別命名為NtAAP2-1和NtAAP2-2，分析了它們的基因結(jié)構(gòu)特征及在煙草組織中的表達(dá)模式。構(gòu)建了 NtAAP2-1和NtAAP2-2基因超表達(dá)載體和RNA干擾載體，進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，并分析了轉(zhuǎn)基因煙草葉片中氨基

3、酸含量的變化，初步研究 NtAAP2-1和NtAAP2-2在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?、倨胀煵軦APs基因家族分析
　　本研究中，分別從林煙草(Nicotiana sylvestris)、絨毛狀煙草(Nicotiana tomentosiformis)、普通煙草(Nicotiana tabacum)中鑒定出7個(gè)、6個(gè)、15個(gè)AAP基因，并且對(duì)煙草中的 AAP基因家族進(jìn)行了多重分析，包括染色體位

4、置、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及關(guān)于保守基序分析等等。分析發(fā)現(xiàn)AAP基因家族成員的氨基酸序列均具有很高的一致性。普通煙草中15個(gè)AAP基因分布在8條染色體上，并且基因序列均被內(nèi)含子隔開(kāi)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示， AAPs蛋白可以分為4個(gè)簇，煙草AAPs蛋白序列主要分布在簇1和簇4中。
　?、跓煵軳tAAP2基因的克隆及分析
　　從普通煙草紅花大金元中成功克隆出了 NtAAP2-1和NtAAP2-2基因的編碼區(qū)序列和基

5、因組序列，其中NtAAP2-1編碼序列長(zhǎng)為1542 bp，編碼513個(gè)氨基酸，蛋白分子量56.99 kDa，等電點(diǎn)9.52；NtAAP2-2編碼序列長(zhǎng)為1539 bp，編碼512個(gè)氨基酸，蛋白分子量56.79 kDa，等電點(diǎn)9.45。兩個(gè)NtAAP2基因的編碼序列相似度達(dá)到了94.42％，氨基酸序列的相似度達(dá)93.76%，NtAAP2-1和NtAAP2-2均含有一個(gè)Aa_trans結(jié)構(gòu)域和12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，并且均為疏水蛋白。進(jìn)化分析和多序

6、列比對(duì)結(jié)果表明，NtAAP2-1與NsyAAP2、NtAAP2-2與NtomAAP2分別互為直系同源。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，NtAAP2-1和NtAAP2-2基因均在盛花期的莖和根中高表達(dá)。
　　③煙草NtAAP2基因轉(zhuǎn)基因株系的創(chuàng)制
　　為了研究NtAAP2-1和NtAAP2-2基因的生物學(xué)功能，分別構(gòu)建了NtAAP2-1、NtAAP2-2基因過(guò)表達(dá)載體和 RNA干擾載體，對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到 T1代轉(zhuǎn)基因煙草。