油茶ACCase基因的克隆及功能研究.pdf

1、油茶(Camellia oleifera Abel)是中國原產(chǎn)且最為重要的木本食用油料樹種。提高油茶種子含油率是今后很長一段時間油茶育種的重大目標和技術(shù)難關(guān)，而且通過常規(guī)育種技術(shù)難以實現(xiàn)。為了實現(xiàn)這個宏大目標，加速油茶品種改良進程，一個可行的方法就是關(guān)注參與脂肪酸和油脂合成的關(guān)鍵酶，克隆控制油茶種子油含量的關(guān)鍵基因，并通過分子育種的方法對現(xiàn)有品種實施遺傳改良，達到提高油茶種子油含量的目的。異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶是各種脂肪酸從頭合成和油脂

2、合成的限速酶和關(guān)鍵酶，它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、α-羧基轉(zhuǎn)移酶(α-CT)和β-羧基轉(zhuǎn)移酶(β-CT)4個亞基組成。本研究以‘華碩’、‘華金’、‘華鑫’、‘衡東號31’、‘衡東65’和‘衡東17號’等6個品種以及‘華碩’的嫩葉、莖段、花芽、雄蕊、雌蕊、子房、4月份幼果、7月份幼果以及成熟種子為材料，從油茶中克隆了ACCase4個亞基的cDNA序列和基因組序列，通過多重RT-PCR與實時熒光定量PCR研究了

3、它們在油茶種子不同發(fā)育階段及不同組織器官中的表達規(guī)律，并在擬南芥中研究它們的過量表達和RNA干擾對油脂合成的影響。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.油茶ACCase4個亞基基因的cDNA克隆。以‘華碩’成熟種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，采用簡并RT-PCR、5’和3’RACE等技術(shù)克隆了油茶ACCase4個亞基的cDNA，分別命名為Co-accB(編碼BCCP)、Co-accC(編碼BC)、Co-accA(編碼α-C

4、T)和Co-accD(編碼β-CT)。(1)油茶ACCase亞基基因accB的全長cDNA為1153 bp，編碼272個氨基酸。并具有前體肽以及與其它三個亞基結(jié)合形成ACCase復合體的成熟肽，其前體肽的剪切位點可能位于Ser-64與Ala-65之間；它含有生物素(酰)化模塊CIIEAMNEIE及生物素化位點Lys。(2)油茶BC亞基基因accC的全長cDNA大小為1638 bp，含有1602 bp的開放讀碼框，編碼533個氨基酸。它具

5、有前體肽以及與其它三個亞基結(jié)合形成ACCase的成熟肽。其前體肽剪切位點可能位于Arg46-Val47之間。并具有BC-1、ATP結(jié)合位點、BC-2以及生物素?；稽c四個亞結(jié)構(gòu)域。(3)油茶ACCase亞基基因accA的部分cDNA序列大小為1293 bp，編碼430個氨基酸。它具有保守的氨基酸序列，并含有乙酰輔酶A結(jié)合域。(4)在克隆ACCaseβ-CT亞基基因accD時，獲得了一個長度為2574 bp的序列，該序列包括1，5-二磷酸

6、核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基基因rbcL(ribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit)(部分序列)、rbcL-accD以及accD(全長cDNA序列)三部分。其中，accD的ORF為1530 bp，編碼510個氨基酸。它含有一個鋅指結(jié)構(gòu)和五個保守序列。在其ORF推導的氨基酸序列中含有乙酰輔酶A、羧基生物素結(jié)合位點以及位于它們之后的羧基轉(zhuǎn)移酶催化位點等結(jié)構(gòu)域。rbc

7、L、rbcL-accD基因間隔及accD的核苷酸序列與二十多種山茶屬植物對應葉綠體基因的核苷酸序列具有高度一致性，這反映了它們具有較近的親緣關(guān)系。油茶ACCase這4個亞基基因推導的氨基酸序列與棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)和大豆(Glycine max)等油料植物以及大腸桿菌ACCase對應亞基基因的氨基酸序列具有較高的一致性，屬于異質(zhì)型ACCase基因；它們具有完成ACCase

8、羧化乙酰CoA兩個半反應以及亞基間相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；核編碼基因accA、accB和accC前體肽剪切后的成熟肽與位于質(zhì)體的β-CT亞基結(jié)合，最終形成具有ACCase活性的多亞基異質(zhì)型復合體。
　　 2.油茶ACCase BC和β-CT亞基基因基因組DNA的克隆。以油茶‘華碩’葉片總DNA為模板，根據(jù)accC和accD的cDNA序列分別設計引物，采用降落PCR技術(shù)，獲得了包括它們基因編碼區(qū)(分別為1602 bp和1533 bp)在

9、內(nèi)的基因組序列。其中，accC的基因組序列長度為1638 bp；rbcL、rbcL-accD以及accD的基因組序列大小為2222 bp；與它們的對應cDNA序列比較后確認這兩個基因均沒有內(nèi)含子。accD上游啟動區(qū)為約529 bp，沒有PEP啟動子位點，含有NEP型啟動子元件，其5'端UTR部分含有-10啟動子元件、CAAT BOX1、YACT、napA E-box、GATA box和DOFCOREZM等位點，并可能與psaI、ycf4

10、、cemA和petA等形成操縱子，在NEP型啟動子控制下以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。在油茶基因組中存在于葉綠體或質(zhì)體的β-CT亞基基因和存在于核基因組中的BC亞基基因可能作為‘小基因組’，在基因組進化過程中內(nèi)含子逐漸被淘汰。所獲得的accD基因組序列與cDNA序列存在著核苷酸差異，這可能與accD基因家族有關(guān)，也可能與基因組序列轉(zhuǎn)錄過程的RNA編輯現(xiàn)象有關(guān)。獲得油茶ACCase兩個BC和β-CT亞基基因組序列為油脂合成及油脂含量影響等研究提供了

11、基因材料和理論依據(jù)。
　　 3.油茶ACCase4個亞基基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達模式研究。以‘華碩’等6個油茶優(yōu)良品種的成熟種子以及‘華碩’嫩葉等不同組織器官和不同發(fā)育階段的種子為材料，分別以它們的cDNA第一鏈為模板，從GAPDH、Actinl和UBC30等參照基因中選取GAPDH做為參照基因；在優(yōu)化GAPDH與分別油茶ACCase4個亞基基因accA、accB、accC和accD同管擴增最佳反應體系和條件的基礎上，研究了油茶AC

12、Case4個亞基基因的表達模式，熒光定量PCR進一步證實和補充了實驗結(jié)果。(1)油茶accB基因在‘華碩’等6個不同含油率種子中的表達差異不十分明顯；熒光定量PCR揭示油茶accB基因在‘衡東17號’、‘衡東65號’和‘華碩’轉(zhuǎn)錄水平較高。油茶accB基因在油茶‘華碩’雌蕊和成熟種子中的轉(zhuǎn)錄水平較高。(2)油茶accC基因在‘華碩’等6個不同含油率種子中的轉(zhuǎn)錄水平差異較為明顯，在‘衡東17號’和‘衡東65’中較多。它的轉(zhuǎn)錄水平與各品種含

13、油率之間的相關(guān)性不十分明顯。(3)油茶accA基因在油茶‘華金’表達量較多，在‘衡東31號’、‘衡東17號’和‘華鑫’種子中轉(zhuǎn)錄水平相似。其表達量與各品種含油率之間的相關(guān)性不明顯。它在油茶‘華碩’成熟種子中的表達量最多，而在其它組織及種子發(fā)育過程中表達量較少。(4)油茶accD基因在‘華碩’等等不同含油率種子中轉(zhuǎn)錄存在著較大差異，在‘華鑫’中表達量最大。它的轉(zhuǎn)錄水平與部分油茶品種含油率之間有一定的相關(guān)性。它在油茶‘華碩’的葉片表達量和發(fā)

14、育的種子中轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　 在油茶種子發(fā)育過程中，這4個ACCase基因轉(zhuǎn)錄量增多的趨勢符合種子由花期到成熟，油脂合成量由小到多而進入高峰期，對脂肪酸需求逐漸增多；種子成熟后，油脂合成逐漸完成，對脂肪酸需求下降的要求。表明這4個ACCase基因轉(zhuǎn)錄與脂肪酸形成關(guān)系密切。我們的研究結(jié)果支持‘異質(zhì)型ACCase的表達量對其活性和種子含油量至關(guān)重要，是種子含油率高低標志這個結(jié)論’以及‘ACCase在決定油料作物含油率具有重要作用’

15、這個假說。油茶異質(zhì)型ACCase各亞基基因協(xié)調(diào)表達，在開花前(后)和種子成熟前后出現(xiàn)了兩個轉(zhuǎn)錄高峰，只是前者不明顯，后者卻十分明顯。另外，這4個基因在油茶組織器官中呈現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)錄水平，這與Ke等的結(jié)論相一致。本研究為我們從轉(zhuǎn)錄水平檢測油茶ACCase亞基基因表達提供一種直觀的方法。
　　 4.ACCase亞基基因accC的過量表達和accA/accB/accC/accD的RNA干擾研究。構(gòu)建了pCAMBIAl304-35S-a

16、ccC植物表達載體，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入哥倫比亞野生型擬南芥中，獲得accC過量表達的轉(zhuǎn)擬南芥T1和T2代抗性植株。利用Gateway技術(shù)，分別構(gòu)建了異質(zhì)型ACCase多亞基基因的干擾載體pJawohRNAi18-accA/accB/accC/accD，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入哥倫比亞野生型擬南芥中分別了獲得它們的T1代轉(zhuǎn)擬南芥抗性植株。這為今后研究異質(zhì)型ACCase基因在種子特異啟動子作用下分別與4個亞基的兩兩組合融合、1個和3個組合融合或4個亞基融

17、合構(gòu)建ACCase過量表達載體，然后轉(zhuǎn)到植物植株中檢測它們的表達效果等研究提供理論準備和物質(zhì)基礎。
　　 綜上所述，本研究獲得油茶ACCase4個亞基基因的cDNA序列和2個亞基基因組序列，分析了油茶ACCase4個亞基基因的結(jié)構(gòu)特點、表達模式以及它們在脂肪酸和油脂代謝途徑中的作用，為油茶品種評價和豐產(chǎn)栽培措施的調(diào)控提供了一種直觀的檢測方法。這將對今后提高油茶種子含油率，增加油茶單位面積產(chǎn)量和總產(chǎn)量以及油茶一些豐產(chǎn)栽培措施的應用