油茶FatB基因的全長cDNA克隆.pdf

1、油茶是我國南方重要的木本油料樹種,也是世界上四大木本油料樹種之一。茶油主要由油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸組成,其含量一般在90％以上,這些不飽和脂肪酸是由游離的飽和脂肪酸經(jīng)脫飽和和延長轉(zhuǎn)變而來的。FatB水解飽和脂?；?ACP的硫酯鍵,釋放出游離脂肪酸和ACP,FatB對于植物油脂庫中脂肪酸的組成有決定性作用。因此研究油茶的FatB基因?qū)τ诮沂居筒栌椭铣傻姆肿訖C制有重要意義。本論文主要研究結果如下:
　　 1.油茶FatB基因的

2、部分cDNA序列的克隆。在本實驗室已構建的油茶cDNA文庫中,鑒定出三條FatB基因,經(jīng)過在線Blast比對確認均為假陽性克隆。以FatB為關鍵詞向GenBank進行搜索,找到6條其他植物FatB的氨基酸序列和全長cDNA序列,通過多序列比對分析,在保守區(qū)設計了一對簡并引物。以構建cDNA文庫所用的油茶優(yōu)良無性系--‘湘林1號’的近成熟種子為材料提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,通過RT-PCR擴增出了一條大小約700bp的條帶,將測序

3、結果去除引物序列后,得到637bp的部分cDNA序列,該片段編碼212個氨基酸。
　　 2.油茶FatB基因cDNA完整末端的克隆。根據(jù)簡并PCR獲得的序列信息,設計了油茶FatB基因5’RACE用的特異引物5-GSP1、5-GSP2、5-NGSP和3’RACE用的特異引物3-GSP。以‘湘林1號’的近成熟種子為材料提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備RACE readycDNA,進行5’RACE和3’RACE擴增。結果得到了6條約900b

4、p的相似但不完全相同的5’RACE片段和3條約1200bp的相似但不完全相同3’RACE片段,證明油茶FatB基因?qū)儆诙嗷蚣易濉?br>　　 3.油茶 FatB基因家族成員cDNA完整編碼區(qū)的分離克隆。將5’RACE片段和3’RACE片段比對后,預測各片段的起始密碼子和終止密碼子的位置,在起始密碼子上游和終止密碼子下游處分別設計引物,以‘湘林1號’的近成熟種子為材料提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,通過RT-PCR擴增,結合隨機測序

5、和生物信息學分析等方法共分離出油茶FatB基因家族的5個成員,分別命名為co-fatb1、co-fatb2、co-fatb3、co-fatb4、co-fatb5,其ORF長度分別為1272bp、1311bp、1305bp、1305bp、1263bp。已將上述基因序列提交至 GenBank,登錄號分別為 FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899674、FJ899673。發(fā)現(xiàn) co-fatb2、co-fatb3、co