大珠母貝外套膜全長cDNA文庫的構(gòu)建與基因克隆分析.pdf

1、大珠母貝（Pinctada maxima）分布于中國、澳大利亞和東南亞沿岸熱帶和亞熱帶海域，是世界上最優(yōu)質(zhì)的育珠貝，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究以大珠母貝為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建其外套膜組織的全長cDNA文庫，測(cè)序篩選了27個(gè)基因，對(duì)其中的4個(gè)基因（Pm-ferL，Pm-cyb5d1，Pm-RPS6，Pm-RPS12）進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)等研究。此外，根據(jù)已知基因設(shè)計(jì)簡并引物，通過同源克隆的方法獲得了3個(gè)與珍珠質(zhì)形成相關(guān)的基因（PMMG1，N3

2、6，N45），并對(duì)其進(jìn)行序列分析、原核表達(dá)和功能研究。 1．大珠母貝鐵蛋白樣蛋白（Pm-ferL）與鐵蛋白H亞基同源。Pm-ferL全長861bp，編碼173個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為20．1kDa，富含Leu、Gln和Glu。在Pm-ferL的5'UTR中發(fā)現(xiàn)一個(gè)鐵離子響應(yīng)元件，能夠形成莖．環(huán)結(jié)構(gòu)，在翻譯水平上對(duì)鐵蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。Pm-ferL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5段a螺旋，可以形成一個(gè)具有鐵氧化酶活性的4-helix串結(jié)構(gòu)。系

3、統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Pm-ferL與合浦珠母貝鐵蛋白樣蛋白進(jìn)化關(guān)系最近。半定量RT-PCR顯示Pm-ferL在外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在肌肉、鰓和性腺中的表達(dá)量，它可能參與體內(nèi)Fe的貯存和貝殼的形成。 2．Pm-cyb5d1（大珠母貝含細(xì)胞色素b5域1）與細(xì)胞色素b5同源，cDNA全長884bp，編碼215個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為25．1kDa，富含Asp和Leu。Pm-cyb5d1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含7個(gè)a螺旋和8個(gè)β折疊，N-

4、端含有一個(gè)與cytb5功能域類似的亞鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，主要由4個(gè)a螺旋組成，與cytb5功能域的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。Pm-cyb5d1蛋白有1個(gè)糖基化序列和12個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Pm-cyb5d1與斑馬魚的cyb5d1進(jìn)化關(guān)系最近，N-端序列在不同物種的cyb5d1之間保守性很高。Pm-cyb5d1在體外能夠高效表達(dá)。 3．Pm-RPS6和Pm-RPS12（大珠母貝核糖體蛋白S6和S12）分別與真核生物核糖體蛋白S

5、6和S12同源。Pm-RPS6的cDNA全長852bp，編碼244個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為28．0kDa。Pm-RPS12的cDNA全長619bp，編碼137個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為15．0kDa，Pm-RPS6蛋白和Pm-RPS12蛋白分別含有核糖體蛋白S6e簽名序列和S12e簽名序列。Pm-RPS6蛋白含有18個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其的磷酸化可能和蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞生長、增殖的調(diào)節(jié)有關(guān)。RPS12在哺乳動(dòng)物中與某些癌癥具有重要的相關(guān)性。但

6、在低等生物中，除作為核糖體的組成成分外，其他功能的相關(guān)研究還未見報(bào)道。Pm-RPS6和Pm-RPS12在體外都能高效表達(dá)。 4．EF-hand結(jié)構(gòu)域在真核生物細(xì)胞內(nèi)鈣離子吸收和運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，在貝類中可能參與貝殼和珍珠質(zhì)的形成。根據(jù)貝類中已報(bào)道的具有EF-hand結(jié)構(gòu)域的蛋白序列設(shè)計(jì)簡并引物，同源克隆得到PMMG1基因（大珠母貝外套膜基因1）。PMMG1基因全長618bp，編碼140個(gè)氨基酸，N-端的22個(gè)氨基酸肽段為信號(hào)肽

7、。PMMG1氨基酸序列與合浦珠母貝PFMG1的一致性為56％，預(yù)測(cè)有兩個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域。選取編碼PMMG1成熟蛋白的cDNA序列插入pET-32a質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，通過IPTG誘導(dǎo)，Ni2-NTA親和層析柱純化，成功獲得預(yù)期大小的融合蛋白。凝膠電泳遷移率的變化證明PMMG1蛋白具有結(jié)合Ca2+/Mg2+的活性，可能參與方解石或者文石晶體的形成。 5．通過同源克隆擴(kuò)增到2種編碼N66類似蛋白的基因，分別命名為N36和N45。

8、N36包含918bp的開放閱讀框，編碼305個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為32．9kDa。N45包含1164bp的開放閱讀框，編碼387個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為44．6kDa．二者都富含Gly、Asn和Asp。N36蛋白不含信號(hào)肽，N45蛋白在N-端有一段22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。N36蛋白和N45蛋白分別有2個(gè)和1個(gè)糖基化序列，分別有9個(gè)和16個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)都由a螺旋、β折疊和無規(guī)卷曲組成。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示N36和N45與N66