大珠母貝金屬硫蛋白cDNA序列克隆與表達研究.pdf

1、大珠母貝（Pinctada maxima）是生產(chǎn)海水大型優(yōu)質(zhì)珍珠最理想的育珠貝。自1985年以來，大珠母貝苗種養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，特別是5cm左右的幼貝很難在海區(qū)養(yǎng)成；同時，由于人工濫捕，大珠母貝野生資源日漸稀少，已瀕臨絕種的危險，大珠母貝養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)了前所未有的困境，嚴(yán)重影響著我國珍珠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而大珠母貝死亡的原因尚不清楚，而水體的污染可能是因素之一。因此，開展污染因子對大珠母貝幼貝的影響研究，對探討大珠母貝的死亡原因、改良

2、種質(zhì)，實現(xiàn)大珠母貝養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
　　 金屬硫蛋白（MT）是一類普遍存在于生物體內(nèi)、分子量低、半胱氨酸含量豐富、能夠與二價重金屬離子結(jié)合的蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白在清除自由基、解除重金屬毒性、參與體內(nèi)微量元素代謝、防止細胞癌變等方面具有重要作用。本研究從大珠母貝cDNA文庫中分離、克隆得到大珠母貝金屬硫蛋白基因（PMMT），開展了原核表達研究，并研究了鎘離子的急性毒性表達規(guī)律，以闡明金屬硫蛋白的作用機理和激活途徑

3、，探討它在大珠母貝應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御保護過程中的作用，為研究大珠母貝的免疫防御體系，培育抗病抗逆的大珠母貝優(yōu)質(zhì)品種奠定基礎(chǔ)。
　　 1.從大珠母貝外套膜cDNA文庫中克隆獲得了大珠母貝金屬硫蛋白的全長cDNA序列，長599bp，5’非翻譯區(qū)（UTR）為75bp，3’UTR為296 bp，開放閱讀框（ORF）為228bp，編碼75個氨基酸。其中半胱氨酸含量豐富，達29.3％；賴氨酸和甘氨酸含量也較高，均為9.3％；不含苯丙氨酸、組

4、氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸。
　　 2.氨基酸序列特征分析發(fā)現(xiàn)，大珠母貝金屬硫蛋白富含Cys-X（1-3）-Cys結(jié)構(gòu)，其中含有9個Cys-X-Cys結(jié)構(gòu)：CRC，CAC，CCC，CQC，CKC，CAC，CGC，CNC，CSC；2個Cys-X-X-Cys結(jié)構(gòu)：CPNC，CTDC；4個Cys-X-X-X-Cys結(jié)構(gòu)：CTDAC，CGDNC，CKVKC，CGVGC；同時還有個2個Cys-Cys結(jié)構(gòu)。大珠母貝金屬硫蛋白的CCC

5、XXXCXCX（X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸）與無脊椎動物金屬硫蛋白的特征序列（CKCXXXCXCX）極為相似，只相差1個氨基酸。大珠母貝金屬硫蛋白末端保守序列為CgCgvgCTTlsdCnCt-dCsCK，與軟體動物的金屬硫蛋白末端保守序列CxCxxxCTGxxxCxCxxxCxCK基本相似，只是CTT代替了CTG。該序列具備金屬硫蛋白的典型特征，是金屬硫蛋白家族的成員。根據(jù)1999年Binz金屬硫蛋白分類方法可將該金屬硫蛋白歸為F

6、maiy2：mollusc MTs，subfamily mo：other mollusc MTs。大珠母貝金屬硫蛋白基因的克隆為深入研究金屬硫蛋白家族的進化以及海洋貝類金屬硫蛋白的多樣性，理解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.構(gòu)建了金屬硫蛋白的原核表達載體pET-32a-PMMT，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實現(xiàn)了大珠母貝金屬硫蛋白在大腸桿菌中的表達，為進一步開展生物活性和功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.根據(jù)所獲得的cDNA

7、序列設(shè)計一對RT-PCR引物，用半定量RT-PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平上檢測了大珠母貝幼貝在不同濃度鎘離子刺激下金屬硫蛋白基因的表達情況。在未受鎘離子刺激的空白組可檢測到金屬硫蛋白基因的表達。在低濃度鎘離子刺激下（0.005mg/L），大珠母貝金屬硫蛋白表達量有所增加，為空白組1.70倍，至中高濃度組（0.05mg/L、0.1mg/L），這一比值分別增加到了1.79和2.08倍，說明鎘離子能夠誘導(dǎo)大珠母貝金屬硫蛋白基因的表達，表達水平隨鎘離