海灣扇貝金屬硫蛋白cDNA序列克隆及其在鎘和鰻弧菌誘導下的表達研究.pdf

1、海灣扇貝是我國1982年從美國引進的優(yōu)良海水養(yǎng)殖品種，并于1991年再次引進復狀，和櫛孔扇貝一起構(gòu)成了我國海洋貝類養(yǎng)殖業(yè)的主體。盡管我國的海洋貝類養(yǎng)殖規(guī)模在過去的幾十年中達到一定水平，養(yǎng)殖總產(chǎn)量也居國際領先地位，但近年來，養(yǎng)殖扇貝病害不斷爆發(fā)流行，造成大規(guī)模死亡，經(jīng)濟損失十分慘重。引起扇貝大規(guī)模死亡的原因是多方面的，其根本原因則是養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和扇貝種質(zhì)的衰退，抗病力下降。所以，在積極調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、加強環(huán)境治理、開展扇貝病原及流行病學研

2、究的同時，改良種質(zhì)增強扇貝的抗病抗逆能力則是解決困擾扇貝養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的根本保證。扇貝中抗逆抗病基因的克隆和表達無疑是研究養(yǎng)殖動物免疫防御機制，提高機體抗病力，實現(xiàn)遺傳改良的基礎和關鍵。 金屬硫蛋白普遍存在于生物體內(nèi)，具有低分子量、富含半胱氨酸、誘導性強等特點。金屬硫蛋白具有很強的金屬結(jié)合能力和氧化還原能力，在生物體內(nèi)參與細胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、重金屬解毒、清除自由基、抵抗電離輻射等，具有較強的生物學功能。本研究從海灣扇

3、貝cDNA文庫中分離、克隆海灣扇貝金屬硫蛋白基因，并研究其在重金屬和病原刺激下的表達規(guī)律，以闡明金屬硫蛋白作用機理和激活途徑，探討它在扇貝應激反應和免疫防御過程中的作用，為全面地研究扇貝的免疫防御體系，培育抗病抗逆的扇貝優(yōu)質(zhì)品種奠定基礎。 首先采用表達序列標簽法，結(jié)合eDNA末端快速擴增技術(shù)，獲得了海灣扇貝(Argopectenirradians)金屬硫蛋白(AIMT)的全長cDNA序列。該序列全長664bp，5'UTR(Unt

4、ranslatedRegion)為41bp，3'UTR為290bp，開放閱讀框(OpenReadingFrame，ORF)長度為333bp，可以編碼110個氨基酸。在其編碼的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高，占25.5％，其次是甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)各占10.9％，賴氨酸(Lys)和絲氨酸(Ser)各占8.2％，不含組氨酸和芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)。對其編碼的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)該序列有無脊椎動物和軟體

5、動物金屬硫蛋白的保守序列模式CKCXXXCXCX，C-末端基本符合軟體動物MT序列模式CxC-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K，但是C-t-x(3)代替了C-T-G-x(3)，末尾由R代替了K。序列特征分析的結(jié)果表明該序列具備金屬硫蛋白的典型特征，是金屬硫蛋白家族的成員。根據(jù)1999年Binz金屬硫蛋白分類方法可將該金屬硫蛋白歸為Family2：molluscMTs，Subfamilymo：other

6、molluscMTs。海灣扇貝金屬硫蛋白基因序列的克隆為深入研究金屬硫蛋白家族的進化過程以及貝類金屬硫蛋白的多樣性，理解其結(jié)構(gòu)與功能的關系提供了理論基礎。 根據(jù)所獲得的eDNA序列設計一對RT-PCR引物，用半定量RT-PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平上檢測了海灣扇貝血細胞金屬硫蛋白基因在不同濃度鎘刺激下的表達情況。在未受鎘刺激的空白組可檢測到金屬硫蛋白基因的表達，與β-actin基因的比值約為0.16。在低濃度鎘刺激下(50μg/L)，

7、AIMT表達量有所增加，與β-actin基因的比值增加到0.28，至中高濃度組(100μg/L、200μg/L)，這一比值增加到了0.51和0.60，說明重金屬鎘能夠誘導海灣扇貝金屬硫蛋白基因的表達，并且基因的表達水平隨鎘離子濃度增加而上升，顯示AIMT與鎘的解毒有關并具有作為指示養(yǎng)殖環(huán)境中鎘污染水平的生物標志物的潛力。 采用熒光定量PCR的方法檢測了鰻弧菌刺激后的不同時間點，海灣扇貝血細胞金屬硫蛋白基因的表達。感染后2小時，A