馬氏珠母貝熱休克蛋白與Toll樣受體基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本研究以馬氏珠母貝(Pinctada martensii)為研究對象,利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的珍珠囊轉(zhuǎn)錄組和植核后6個時期珍珠囊的數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫。從中篩選出熱休克蛋白基因和Toll樣受體基因的Unigene片段。應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從馬氏珠母貝外套膜中克隆了熱休克蛋白60基因（PmHSP60)、熱休克蛋白90基因(PmHSP90)、Toll樣受體4基因(PmTLR4)、Toll-like protein基因(PmTL

2、P)的cDNA序列全長,對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。并分析了四個基因的組織表達(dá)及在應(yīng)激后不同時間點(diǎn)的表達(dá)。結(jié)果如下:
　　1.四個免疫基因cDNA全長的獲取及其序列分析:PMHSP60基因cDNA全長為2495 bp,開放閱讀框?yàn)?734 bp。PmHSP90基因cDNA全長為2584 bp,開放閱讀框?yàn)?160 bp,編碼719個氨基酸。PmTLR4基因cDNA全長3138 bp,開放閱讀框2697 bp,編碼899個氨基酸。Pm

3、TLP基因cDNA全長為2214 bp,其中開放閱讀框?yàn)?043 bp,編碼681個氨基酸。同源性比對分析發(fā)現(xiàn),PmHSP60和PmHSP90與其他軟體動物的序列具有高度同源性,PmHSP60與光滑雙臍螺的相似度最高,達(dá)78％。PmHSP90基因與太平洋牡蠣的序列相似性達(dá)89%;而PmTLR4和PmTLP基因與其它物種的相似度較低,PmTLR4與地中海貽貝的Toll樣受體f前體的相似度最高,為34%。PmTLP與太平洋牡蠣toll pr

4、otein和TLR6的序列相似性分別為為38%和32%。氨基酸序列分析顯示:PmHSP60氨基酸序列具有典型的mt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重復(fù)基序和一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域;PmHSP90具有HSP90家族典型的五個特征基序:NKEIFLRELISN[A/C/S]SDALDKIR,LGTIA[K/R] SGTIG QFGV GFYSAYLVA[E/D],IKLYVRRVFI,GVVDSEDLPLNISRE和C端的MEEVD

5、;PmTLR4和PmTLP具有Toll樣蛋白家族典型的TIR結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域。
　　2.四個基因的組織差異表達(dá)分析:以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因,應(yīng)用Real-time PCR技術(shù),研究了PmHSP60、PmHSP90、PmTLR4和PmTLP四個免疫基因在馬氏珠母貝閉殼肌、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺和鰓等6個組織中的表達(dá)變化。分析表明這4個免疫基因在各組織中均有表達(dá),且在肝胰腺和鰓中有較高水平的表達(dá),而在閉殼肌等非免疫組織中

6、表達(dá)量較低。
　　3.在三種應(yīng)激(即脂多糖刺激、植核育珠移植耐受應(yīng)激、熱刺激)條件下,四個基因的時序表達(dá)模式。脂多糖(LPS)刺激后,4個免疫基因均出現(xiàn)明顯上調(diào)。其中,PmHSP60在LPS注射后6 h達(dá)到最大表達(dá)量,而另外3個免疫基因PmHSP90、PmTLR4和PmTLP相對表達(dá)趨勢相似,均在3 h表達(dá)量達(dá)到最高水平?？偟膩碚f,這4個免疫相關(guān)基因都能夠響應(yīng)LPS刺激,這些基因的表達(dá)譜特點(diǎn)是快速響應(yīng)而后逐步下降;在植核后的不同時

7、期,PmHSP60在植核后0-1 d出現(xiàn)短暫的上調(diào),隨后出現(xiàn)下調(diào),并在第3 d出現(xiàn)回升,并在第5 d表達(dá)水平達(dá)到最高,而PmHSP90和PmTLR4在植核后的0-2d就出現(xiàn)明顯的上調(diào),并都在第2 d表達(dá)量達(dá)到最大;熱脅迫下,貝血淋巴組織中的HSP60和HSP90 mRNA表達(dá)量有明顯的提高。PmHSP60 mRNA表達(dá)水平熱刺激后的12 h達(dá)到最大表達(dá)量,是空白對照組(0 h)的12.28倍(P<0.05);而PmHSP90在熱刺激后3

8、 h表達(dá)量達(dá)到最大,是空白對照組的28.89倍(P<0.05)。
　　4.PmHSP60的原核表達(dá):構(gòu)建了pET28-HSP60的原核表達(dá)載體,在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為約61.79 kDa的蛋白條帶,并對表達(dá)溫度、誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化。在37℃,10 h和0.1 mM的IPTG濃度條件下重組蛋白的可溶性表達(dá)量最高。
　　綜上所述,本論文的研究結(jié)果為探討馬氏珠母貝免疫防御相