謝氏寬漠王熱休克蛋白基因的克隆及表達(dá).pdf

1、謝氏寬漠王Mantichoru lasemenowi Reitter隸屬于鞘翅目Coleoptera擬步甲科Tenebrionidae漠甲亞科Pimeliinae漠甲族Pimeliini寬漠王屬Mantichorula Reitter。是分布在我國內(nèi)蒙古阿拉善東部、寧夏中北部和蒙古國南緣的一個特有物種，其成蟲能在沙表74℃的極端高溫下活動并利用小生境繁衍生息，受環(huán)境脅迫形成了特殊的生理生態(tài)適應(yīng)特征。了解謝氏寬漠王的熱休克蛋白（heats

2、hockprotein，HSP）基因調(diào)控，研究其在惡劣環(huán)境下的生物抗逆機制在理論和應(yīng)用上都有重要的意義。
　　 本論文以謝氏寬漠王為研究材料。研究內(nèi)容主要分為3個部分：
　　 第1部分：通過RT-PCR及RACE技術(shù)從謝氏寬漠王體內(nèi)克隆獲得與昆蟲抗高溫機制相關(guān)的2種不同hsp70基因的cDNA序列，并對其核苷酸和編碼的蛋白序列進行了生物信息學(xué)分析；
　　 第2部分：通過同源克隆得到謝氏寬漠王β-actin基因，檢

3、測了β-actin基因作為分子內(nèi)標(biāo)的可靠性，并建立了1種以在昆蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的管家基因β-actin為分子內(nèi)標(biāo)的半定量RT-PCR方法。以此方法對熱激條件下謝氏寬漠王體內(nèi)Mshsp70、Mshsc70基因的mRNA表達(dá)水平進行相對定量研究；
　　 第3部分：構(gòu)建了謝氏寬漠王Mshsp70基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌DE3體內(nèi)進行誘導(dǎo)表達(dá)，并以純化后的蛋白免疫家兔制備抗體。
　　 研究結(jié)果如下：
　　 （1）謝

4、氏寬漠王Mshsp70基因cDNA序列2137bp，編碼區(qū)長1950bp，5'端非翻譯區(qū)為19bp，3'端非翻譯區(qū)為168bp?？删幋a649個氨基酸殘基，理論分子量為71.34KD，同源性分析表明該基因與異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的核苷酸序列相似性高達(dá)85％，推導(dǎo)的氨基酸序列與赤擬谷盜Triboliumcastaneum蛋白序列相似性達(dá)92％。
　　 （2）謝氏寬漠王Mshsc70基因cDNA序列1908bp，編碼

5、區(qū)長1808bp，3'UTR為100bp。編碼601個氨基酸殘基。理論分子量為57.85KD，同源性分析表明該基因的核苷酸序列和蛋白序列與赤擬谷盜的序列相似性分別為80％，85％。
　　 （3）謝氏寬漠王β-actin基因cDNA序列全長1372bp，包含一個長度為1131bp的開放閱讀框，編碼376個氨基酸。5'和3'末端非翻譯區(qū)域（UTR）分別為66bp和175bp；該數(shù)據(jù)與其他動物β-actin基因核苷酸序列具有96％～9

6、9％高度同源性。將該序列提交GenBank，獲得序列號為EU825991。β-actin表達(dá)量檢測結(jié)果顯示熱激后不同恢復(fù)時間其表達(dá)量無明顯變化，且與未經(jīng)熱激處理的對照相比無顯著差異，可以作為研究受外界環(huán)境脅迫作用下昆蟲體內(nèi)不同基因表達(dá)水平高低的可靠內(nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)。
　　 （4）通過半定量RT-PCR分析：謝氏寬漠王在未經(jīng)熱處理的正常條件下，Mshsp70和Mshsc70均有表達(dá)，但是室溫恢復(fù)過程中，2個基因具有截然不同的表達(dá)趨勢。

7、經(jīng)42℃熱激1h后立即誘導(dǎo)Mshsp70表達(dá)至最高峰；在恢復(fù)到室溫的1～4h內(nèi)Mshsp70表達(dá)量逐漸降低，但仍然高于未熱激對照組。而Mshsc70在42℃熱激1h后表達(dá)受到抑制，但在恢復(fù)2～4h內(nèi)有少量的表達(dá)。
　　 （5）利用高效原核表達(dá)載體pET-DsbA，成功構(gòu)建了謝氏寬漠王Mshsp70基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌DE3中37℃培養(yǎng)，IPTG終濃度為1mM誘導(dǎo)3h獲得成功表達(dá)。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，融合蛋白