低氧脅迫下鰱微管蛋白相關基因及熱休克蛋白70的表達分析.pdf

1、本文以鰱（Hypophthalmichthys molitrix）為研究對象，開展了其微管蛋白(Microtubulin)相關基因(TUB84和TUBA2)及誘導型熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的克隆，組織表達以及低氧脅迫過程中這三個基因在鰱心臟、腦、肝臟、脾、腎臟、肌肉中的表達分析。同時我們檢測了HSP70和組成型熱休克蛋白70(heatshock cognate protein70，HSC70

2、)在鰱上述這些組織中的蛋白表達變化以及在窒息后拯救過程中腦中HSP70的表達變化。實驗結果如下:
　　 1.TUB84和TUBA2的基因克隆及低氧脅迫下的表達分析
　　 采用同源克隆和RACE技術獲得了鰱α微管蛋白的兩個基因亞型的cDNA全長序列，分別命名為TUB84和TUBA2。TUB84基因全長1490bp，5'非編碼區(qū)453bp，3'非編碼區(qū)143bp，最大開放閱讀框894bp，編碼297個氨基酸;TUBA2基因全

3、長1815bp，5(')非編碼區(qū)105bp，3'端703bp，最大開放閱讀框1007bp，編碼449個氨基酸;氨基酸序列同源一致性比對結果顯示，鰱TUB84和TUBA2與斑馬魚氨基酸序列同源一致性最高，分別為98％、97％。
　　 利用RT-PCR方法檢測了TUB84和TUBA2兩個基因在鰱的心臟、腦、肝臟、脾、腎、鰓、肌肉等組織中的表達分布情況，結果表明這兩個基因在鰱的這7個組織中均有分布，且表達差異不顯著。Real-time

4、 PCR檢測結果顯示，低氧脅迫2h，TUBA2的基因表達僅在心臟中略有升高，但不顯著(P＞0.05)，在其他組織中沒有明顯變化，而TUB84在各個組織中都沒有明顯變化;低氧脅迫4h，TUB84在心臟中表達明顯下降(P＜0.05)，在腦中略有升高但不顯著(P＞0.05)，在其他組織中無明顯變化，而TUBA2在腦、肌肉、心臟中表達都有所增加但不顯著(P＜0.05);低氧脅迫6h，TUB84在肝臟、腎、肌肉中表達明顯上升(P＜0.05)，在脾

5、臟和腦中表達增加不明顯(P＞0.05)，在心臟中表達顯著下降(P＜0.05)，而TUBA2則在肝臟、脾臟和腎中表達明顯升高(P＜0.05)，在心臟中出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)，在腦和肌肉中無明顯變化;低氧脅迫8h，TUB84除了在腎臟中有明顯升高外(P＜0.05)，在其他組織中均無明顯變化，TUBA2除了在肝臟和腎中明顯升高外(P＜0.05)，在其他組織中也無明顯變化;低氧脅迫10h，TUB84在腎中表達減少至正常水平，在脾臟中有所增

6、加(P＜0.05)，在其他組織中無明顯變化，而TUBA2在肝臟和腎中都明顯減少，但在肝臟中仍高于正常水平，在腎中顯著低于正常水平(P＜0.05)，在其他組織中無明顯變化。由此可知，本研究中獲得的兩個微管蛋白基因TUB84和TUBA2的表達受低氧應激的調節(jié)。
　　 2.鰱誘導型HSP70 cDNA的克隆及表達分析
　　 采用同源克隆和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends

7、，RACE)擴增鰱HSP70基因的全長cDNA;以DNA為模板進行PCR擴增該序列的編碼區(qū)驗證其是否含有內(nèi)含子;分別利用RT-PCR和Real-time PCR法檢測HSP70mRNA在鰱各個組織中的分布情況及在急性低氧脅迫下其在腦組織中的表達變化。實驗結果克隆得到鰱HSP70全長cDNA，全長為2339bp，包括67bp的5'非編碼區(qū)，1932bp的編碼643個氨基酸的閱讀框和340bp的3'非編碼區(qū);基因組PCR擴增證實該基因不含內(nèi)

8、含子。
　　 半定量RT-PCR檢測結果顯示鰱HSP70基因在心臟、腦中表達量較高，在肝臟、肌肉、腎臟、脾中表達量較低。Real-time PCR結果表明，低氧脅迫過程中HSP70mRNA在各個組織中的表達量呈現(xiàn)出不同程度的變化趨勢:在心臟中呈現(xiàn)出先升高后下降的表達趨勢，低氧脅迫4h表達量達最高，10h時仍顯著高于正常水平(P＜0.05);在腦中總體呈升高的趨勢，雖在10h有所下降，但仍顯著高于對照組(P＜0.05);在脾臟和腎

9、中也呈現(xiàn)出升高的表達趨勢，且均在低氧脅迫10h達到最大值;而在肌肉中則出現(xiàn)前期無明顯變化，10h表達明顯升高，且顯著高于對照組(P＜0.05);在肝臟中的表達呈現(xiàn)波動性變化，4h表達量顯著增加(P＜0.05)，而在6h降到了正常水平，隨后又出現(xiàn)表達上調，10h達到最大值。由此可知，鰱HSP70的基因表達受低氧應激的調節(jié)，而HSP70 mRNA在各個組織中的表達上調可能是鰱應對低氧脅迫時的應激機制。
　　 3.低氧脅迫下兩種熱休克

10、蛋白70的表達變化
　　 ELISA檢測結果表明，低氧脅迫過程中HSC70在鰱各個組織中表達沒有明顯變化，而HSP70在鰱各個組織中呈現(xiàn)不同的表達趨勢。肝臟中HSP70的表達呈波動性變化，除了6h低于正常水平外均顯著高于正常水平(P＜0.05);心臟中HSP70的表達呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，4h達到最大值;腦中HSP70的表達總體呈現(xiàn)出升高的趨勢，雖在10h有所下降，但仍顯著高于對照組(P＜0.05);在脾臟和肌肉中，低氧脅

11、迫8h才出現(xiàn)明顯的升高;在腎中，HSP70的表達呈現(xiàn)出波動性變化，4h表達顯著低于正常水平，隨后升高，8h達到最高值，10h表達又出現(xiàn)下降，但仍高于正常水平。
　　 對窒息后的鰱開展拯救實驗，20±5 min后鰱開始正常游動，Real-time PCR檢測從鰱窒息到拯救180 min過程中腦中HSP70的表達顯示，拯救15 min、30 min時，腦中HSP70表達量顯著高于窒息時的水平(P＜0.05)，而在拯救45 min到1