馬氏珠母貝植核育珠移植耐受免疫相關(guān)基因與蛋白質(zhì)鑒定及分析.pdf

1、馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)是我國重要的人工海水育珠貝。海水珍珠培育的最核心環(huán)節(jié)是植核育珠技術(shù):即將珠核和細胞小片（來源于供體貝）移植到受體貝的內(nèi)臟團，受體貝組織和細胞小片共同形成珍珠囊，分泌珍珠質(zhì)形成珍珠。植入的珠核和細胞小片在受體貝體內(nèi)會引起免疫排斥反應(yīng)，可能會導(dǎo)致受體貝排出植入的珠核，甚至死亡。因此，長期以來，科研人員及養(yǎng)殖者都積極采取各種措施以試圖降低植核育珠中的免疫排斥反應(yīng)，但到目前為止，未

2、能解決此類問題，其根本原因是機體針對植核育珠應(yīng)激的免疫應(yīng)答關(guān)鍵因子尚未明了。
　　本研究以馬氏珠母貝為研究對象，通過植核育珠手術(shù)培育珍珠，以植核后不同時期馬氏珠母貝血淋巴細胞為研究材料，通過RNA高通量測序(RNA-seq)技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，并對其進行測序、組裝和生物信息學(xué)分析，分析免疫相關(guān)基因的差異表達并篩選關(guān)鍵信號通路，確定參與此過程的差異表達基因;同時運用同位素相對與絕對定量(iTRAQ)技術(shù)與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS

3、/MS)技術(shù)聯(lián)用，對植核后不同時期的血細胞總蛋白質(zhì)進行了定量分析，篩選植核育珠過程中的免疫相關(guān)蛋白質(zhì)。結(jié)果如下:
　　利用轉(zhuǎn)錄組測序得到植核育珠過程中7個不同時期的血細胞轉(zhuǎn)錄組文庫，合并為1個轉(zhuǎn)錄組文本集，共得到81，390個unigene，預(yù)測到的CDS共有36，604個。注釋到NR、Swiss-Prot、COG和GO庫的unigene分別有31，689個、25，253個、12,065個和12,720個。其中COG分類中有1，6

4、36個unigene的功能是未知的。大約有21，811個unigene可能參與302個已知的代謝通路。與植核前相比，植核育珠后5天、10天、15天、20天、30天和60天分別有3，345、6，846、4，636、4，167、4，716和6，679個差異表達基因，且在植核育珠后第10天差異表達基因數(shù)目最多。從植核育珠后不同時期差異表達基因中篩選出的46個免疫相關(guān)基因，分別編碼溶菌酶、清道夫受體、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、甘露糖受

5、體、凝集素和Toll樣受體等蛋白。在不同時期的差異表達基因的KEGG富集結(jié)果中都發(fā)現(xiàn)細胞粘附分子(cell adhesionmolecules)通路和原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiencies)通路被顯著性富集(P＜0.05)。
　　利用iTRAQ技術(shù)并結(jié)合LC-MS/MS，對馬氏珠母貝植核前、植核育珠后10天、20天和30天的血細胞總蛋白質(zhì)進行了相對與絕對定量分析，共采集到277，226張二級質(zhì)譜圖，鑒

6、定到的肽段數(shù)目為43，421條，獲得的蛋白質(zhì)有2，702個。與植核前相比，植核育珠后10天、20天和30天的血細胞中分別有97、103和101種顯著差異蛋白。10天與植核前相比，有37個上調(diào)蛋白、60個下調(diào)蛋白;20天與10天相比，得到29個差異蛋白，其中21個上調(diào)，8個下調(diào);30天與20天相比，有12個上調(diào)差異蛋白、9個下調(diào)差異蛋白。獲得的免疫相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有原鈣黏蛋白(Protocadherin)、血纖維蛋白溶酶原(Plasmin

7、ogen)、細胞凋亡蛋白酶(caspase)、干擾素誘導(dǎo)蛋白、白介素17受體、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子相關(guān)因子、熱休克蛋白70、TRIM家族蛋白、TNF-α誘導(dǎo)蛋白、Notch家族蛋白、抗菌L-氨基酸氧化酶、E3泛素連接酶、整合素、死亡相關(guān)蛋白激酶、肽聚糖識別蛋白等。
　　本研究分別從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩個方面研究了馬氏珠母貝植核育珠后不同時期血淋巴中與免疫相關(guān)的差異表達基因和蛋白質(zhì)，不僅豐富了馬氏珠母貝的cDNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，而