基于RNA測序技術(shù)的馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組及數(shù)字基因表達(dá)譜分析.pdf

1、本文以我國海水珍珠的主要生產(chǎn)貝類——馬氏珠母貝(Pinctada martensii)的珍珠囊為研究對象,構(gòu)建了1個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫和6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression,DGE)文庫,運(yùn)用新興的RNA高通量測序(RNA-seq)技術(shù)對構(gòu)建的文庫開展測序、組裝和生物信息學(xué)分析。同時(shí),利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Real—time PCR,qRT-PCR)擴(kuò)增免疫和礦化相關(guān)基因在6個(gè)不同發(fā)育階段的表達(dá)

2、變化規(guī)律,以達(dá)到驗(yàn)證測序分析的目的。
　　 對轉(zhuǎn)錄組文庫測序,得到39,400,004條原始reads,總核苷酸數(shù)為3,546,000,360nt。其中,GC含量、Q20和未知堿基的百分比分別為42.94％、94.65％和0.01％。對原始reads進(jìn)行拼接組裝,得到102,762條Unigene,其中有46,387個(gè)功能完整的各種長度編碼區(qū)域被識別,且這些Unigene編碼的蛋白大多數(shù)都超過了200個(gè)氨基酸。這些轉(zhuǎn)錄本中,大約

3、有23,081條Unigene可能參與了219個(gè)已知的代謝或信號通路。與Nr數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫、GO分類和COG數(shù)據(jù)庫比對,分別有36,989、30,592、7,700和10,414個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋或分類,COG分類揭示有447個(gè)轉(zhuǎn)錄本的功能目前尚未被報(bào)道。已注釋的轉(zhuǎn)錄本中有453條Unigene與無脊椎動物免疫基因相關(guān),103條與生物礦化基因相關(guān)。
　　 對珍珠囊發(fā)育第5、10、15、20、30和60天的DGE文庫

4、測序,得到的原始Tag均為5,000,000,去除雜質(zhì)標(biāo)簽后得到Clean Tag分布在250萬到.340萬之間,平均占總Tag數(shù)的94.91％；六個(gè)DGE數(shù)據(jù)庫能夠比對到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的Clean Tag占總Clean Tag的26.32％,即在珍珠囊發(fā)育的6個(gè)時(shí)期中,一些高表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄組文庫中沒有出現(xiàn)。珍珠囊發(fā)育的第5、10、15、20和30天的表達(dá)譜與第60天的相比,分別有2192、1902、2108、1475和1368個(gè)差異

5、表達(dá)基因,尤其是在第15天差異表達(dá)基因數(shù)目有明顯增加的趨勢。與轉(zhuǎn)錄組文庫比較分析發(fā)現(xiàn),在153條與免疫相關(guān)的Unigene中,30條在珍珠囊不同發(fā)育時(shí)期有顯著差異表達(dá)(P<0.05),它們分別編碼溶菌酶、Toll樣受體、堿性磷酸酶、清道夫受體、酸性磷酸酶和凝集素等蛋白；在103條與生物礦化相關(guān)的Unigene中,13條在珍珠囊發(fā)育不同時(shí)期有顯著差異表達(dá)(P<0.05),它們分別編碼皮連蛋白、酪氨酸類似蛋白、perlwapin、鈣調(diào)素蛋白

6、家族等蛋白。
　　 從有顯著差異表達(dá)的Unigene中選擇與免疫和礦化相關(guān)的基因各一個(gè),進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,溶菌酶基因在珍珠囊發(fā)育前30天的表達(dá)水平處于較低的水平,在第30天表達(dá)顯著上調(diào),然后開始下調(diào),第60天時(shí)表達(dá)水平基本恢復(fù)到原來狀態(tài)。皮連蛋白基因在珍珠囊發(fā)育的前20天沒有明顯的差異表達(dá),第30天時(shí)該基因發(fā)生顯著上調(diào),直到第60天該基因的表達(dá)基本保持了較高的水平。熒光定量對這兩個(gè)基因表達(dá)的分析結(jié)果與DGE檢