高粱全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建和分析及玉米ZmBIP基因的功能鑒定.pdf

1、作為禾本科作物中的C4植物，高粱具有高光合效率和高水分利用率的特點(diǎn)，它適應(yīng)在高溫和干旱地區(qū)種植，是一個(gè)典型的抗旱性較強(qiáng)的作物。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)包含大量含有完整閱讀框架的基因。構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，是挖掘和利用高粱抗旱基因，規(guī)?；寺『万?yàn)證基因功能的重要途徑。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1、提取干旱脅迫處理下高粱5個(gè)組織的RNA，采用了改良的Oligo-capping方法，構(gòu)建了干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)高粱全長(zhǎng)均一化cDNA文庫(kù)。文庫(kù)的庫(kù)容

2、量為2.24×106cfu，插入片段的平均長(zhǎng)度大于1kb，重組率為93％。
　　2、隨機(jī)挑選了1萬(wàn)條單克隆進(jìn)行5'端單向測(cè)序，經(jīng)拼接處理得到4337個(gè)unigene。對(duì)4337個(gè)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括GO功能分類、轉(zhuǎn)錄因子分析、KEGG信號(hào)通路分析和基因組定位等。GO功能注釋結(jié)果顯示，受外界刺激響應(yīng)的基因有152個(gè)，具有抗氧化活性功能的基因有50個(gè)，編碼連接核苷酸的轉(zhuǎn)錄因子的基因有193個(gè)、具有電子傳遞活性功能的基因67個(gè)。

3、這些基因可能參與植物的干旱響應(yīng)信號(hào)途徑。通過(guò)BLASTx程序與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中的氨基酸序列比對(duì)，確定了351個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中ERF家族所占比例最高，為6.8％。WRKY家族基因、MYB_ related家族、NAC家族基因，各占351個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的5.9％、5.1％、4.8％。本研究挖掘到的轉(zhuǎn)錄因子，主要集中在與抗旱響應(yīng)信號(hào)途徑有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族中，編碼這些轉(zhuǎn)錄因子的基因可作為功能驗(yàn)證的候選基因。KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果表明，在光

4、合組織的碳固定通路中，涉及到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PPC)、丙酮酸磷酸雙激酶基因(PPDK)等;在過(guò)氧化物酶途徑中，涉及到過(guò)氧化物酶家族基因（PEX1、PEX5、PEX6等）。全長(zhǎng)文庫(kù)unigene序列中有4071條序列定位到高粱基因組中，占93.87％。其中，3841條序列定位到基因組中單一位點(diǎn)，說(shuō)明單拷貝的基因在高粱中所占比例較高。
　　3、采用全長(zhǎng)cDNA過(guò)表達(dá)系統(tǒng)（FOX系統(tǒng)）進(jìn)行了高粱全長(zhǎng)文庫(kù)基因的功能驗(yàn)證。構(gòu)建了

5、高粱FOX系統(tǒng)，通過(guò)分子檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。
　　4、分析了玉米抗旱自交系旱21中BIP基因家族的功能。經(jīng)過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證，玉米中ZmBIP1和ZmBIP2基因均受甘露醇脅迫誘導(dǎo)有不同程度的下調(diào)表達(dá)。將ZmBIP1和ZmBIP2基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥中，過(guò)表達(dá)ZmBIP1和ZmBIP2基因?qū)е缕浞N子萌發(fā)時(shí)期對(duì)鹽和甘露醇脅迫的耐受能力減弱，過(guò)表達(dá)ZmBIP2基因的轉(zhuǎn)基因植株在生殖生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)鹽脅迫敏感。推測(cè)ZmBIP1和ZmBIP