玉米小G蛋白基因Zmrab6全長cDNA的克隆、鑒定和分析.pdf

1、Rab蛋白屬于Ras蛋白超家族的小G蛋白(smallG-proteinorsmallGTPase)，分子量大多在22-25kDa之間。Rab蛋白作為真核細(xì)胞中各細(xì)胞器之間囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_關(guān)，在囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌A段調(diào)節(jié)囊泡特定的運(yùn)輸途徑。 本實(shí)驗(yàn)通過對已知的玉米苗期水分脅迫誘導(dǎo)表達(dá)cDNA文庫進(jìn)行篩選，獲得一個玉米小GTP結(jié)合蛋白(smallGTP-bindingprotein，SGP)的相關(guān)序列，序列測定后以該cDNA序列為基礎(chǔ)進(jìn)

2、行了電子延伸，根據(jù)電子延伸的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法獲得了一個玉米(Zeamays)中尚未鑒定的cDNA克隆Zmrab6，編碼框長627bp，編碼208個氨基酸的蛋白質(zhì)。它與水稻(Oryzasativa)的GTP-bindingproteinRab6和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的putativesmallGTP-bindingprotein(序列登錄號分別是NP912248.1和AAM65455.1)在蛋

3、白質(zhì)水平上有著高度同源性(氨基酸序列ID值分別大于98％和94％)，同屬小G蛋白家族的Rab亞族。 Sourthern吸印/雜交表明Zmrab6在玉米基因組中可能是以兩個拷貝存在，Northern吸印/雜交結(jié)果表明干旱、ABA、PEG等逆境都誘導(dǎo)了Zmrab6表達(dá)量增加。因此認(rèn)為Zmrab6在干旱、ABA等逆境脅迫中起到了某些作用。 將Zmrab6基因的編碼序列按正確讀碼框重組到具有六個組氨酸尾(His-Tag)融合標(biāo)簽

4、的pET-30a(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)融合蛋白的菌株，經(jīng)Ni-NTA瓊脂膠柱純化，獲得了純化的目標(biāo)融合蛋白。GTP結(jié)合試驗(yàn)表明，在原核細(xì)胞中表達(dá)出的融合蛋白具有體外結(jié)合GTP的能力。 為了進(jìn)一步研究該基因的功能，構(gòu)建了兩個表達(dá)載體(過量表達(dá)、RNAi干擾)并將其分別轉(zhuǎn)化擬南芥。對轉(zhuǎn)基因擬南芥T3、T4代純合體株系進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義載體的擬南芥明顯比野生型擬南芥生長緩慢，其開花、抽苔、結(jié)莢分別比野