小麥TaMBD2基因的全長cDNA克隆及互作蛋白的篩選.pdf

1、為了探討甲基結(jié)合蛋白TaMBD2在小麥生長發(fā)育過程中的調(diào)控功能，通過RACE技術(shù)克隆了小麥TaMBD2基因的cDNA全長，構(gòu)建了TaMBD2的酵母表達載體，并利用酵母雙雜交系統(tǒng)對TaMBD2互作蛋白進行了初步篩選，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.通過RACE技術(shù)克隆到了TaMBD2的cDNA全長，序列分析顯示，TaMBD2的cDNA全長為1511bp，其中5’-UTR164bp，3’-UTR405bp，ORF942bp；該基因編碼

2、的蛋白包含313個氨基酸，推測的分子最為34.65kD，等電點為5.21；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，TaMBD2包含典型的甲基結(jié)合蛋白保守域(143～221位氨基酸)和1個CW型的鋅指結(jié)構(gòu)域(80～132位氨基酸)。甲基結(jié)合蛋白保守域與玉米的MBD111(EU965071)、MBD108(AY029560)和擬南芥的AtMBD2(NM＿203121)的一致性分別為96％、92％和68％；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，TaMBD2的甲基結(jié)合域可形成由3個β

3、-折疊和2個α-螺旋組成的特定夾層結(jié)構(gòu)。
　　 2.成功構(gòu)建了酵母誘餌表達載體PGBKT7-TaMBD2，并驗證了在酵母細胞中沒有毒性和自激活，Westernblot檢測能成功表達出目的蛋白。
　　 3.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選TaMBD2的互作蛋白，總共篩選到了91個克隆，其中37個完成了測序，blastx分析結(jié)果表明，其中有21個序列推測編碼NDPK3(nucleosidediphosphatekinase，二磷酸核苷

4、激酶)，有9個序列推測編碼ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白(epsinN-terminalhomologydomain-containingprotein)，其余的功能推測分別為SIAN蛋白(seveninabsentiafamilyprotein)，Agenet結(jié)構(gòu)域蛋白(agenetdomain-containingprotein)；C2H2型鋅指蛋白(zincfingerC2H2typefamilyprotein)和假定蛋白(hypotheti

5、calprotein)。
　　 4.NDPK在生物體內(nèi)廣泛存在并且高度保守，是一類催化NTP的γ-磷酸基因轉(zhuǎn)移到NDP的酶類，在維持細胞內(nèi)三磷酸核苷酸的平衡中發(fā)揮著重要的功能，另外它可以通過影響細胞骨架而引起細胞運動，使G蛋白激活，從而介導(dǎo)細胞信號傳導(dǎo)，最近的研究表明，NDPK蛋白可能發(fā)揮其他重要的調(diào)控功能。ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白是一類也在植物體廣泛分布，參與膜運輸?shù)牡鞍?。其主要在招募泛素化蛋白結(jié)合在一定位點上，并且?guī)椭灰号菪纬?/p>