口蝦蛄卵黃蛋白原基因cDNA全長序列的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、 分類號(hào) 分類號(hào) 密 級(jí) U D C 編 號(hào) 碩 士 學(xué) 位 論 文 口蝦蛄卵黃蛋白原基因 cDNA 全長 序列的克隆及表達(dá)分析 張娜 1222010 指導(dǎo)教師姓名 劉海映 教授 專 業(yè) 名 稱 漁業(yè)

2、資源 論文答辯日期 2015 年 6 月 3 日 學(xué)位授予日期 2015 年 6 月 日 摘要 I 摘要 口蝦蛄(Oratosquilla oratoria) 是我國沿海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物之一，是具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)良品種。近年來由于過度捕撈和海區(qū)環(huán)境的破壞，致使其資源量減少，對其進(jìn)行人工繁育和資源保護(hù)勢在必行，而進(jìn)行人工繁育和資源保護(hù)的前提是了解其繁殖發(fā)育規(guī)律，這包括了解與繁殖

3、有關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)模式。本研究以口蝦蛄繁殖發(fā)育中重要基因——卵黃蛋白原基因?yàn)檠芯繉ο?，對其進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，以期豐富口蝦蛄繁殖生物學(xué)的研究內(nèi)容，為全面了解口蝦蛄的繁殖規(guī)律，進(jìn)而進(jìn)行人工繁育和資源保護(hù)奠定重要基礎(chǔ)。 在動(dòng)物繁殖發(fā)育中，卵黃蛋白原(Vitellogenin，Vg)是存在于非哺乳類卵生動(dòng)物成熟雌性個(gè)體中的一種蛋白，是卵黃蛋白(Vitellin,Vn)的前體。卵黃是卵生動(dòng)物卵巢以及卵中的主要物質(zhì)，卵黃蛋白是構(gòu)成卵黃的主要部分，

4、并在卵黃發(fā)生期迅速積累。在卵生動(dòng)物中，Vg 不僅為成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育成胚胎提供蛋白質(zhì)、糖類、脂肪以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，還能結(jié)合金屬離子（例如 Zn2+ ,Fe3+,Cu2+,Mg2+,Ca2+）并作為載體攜帶它們進(jìn)入到卵母細(xì)胞中。卵黃蛋白原在卵黃發(fā)生期能攜帶類胡蘿卜素、甲狀腺素、視黃醇、核黃素進(jìn)入卵母細(xì)胞。此外，卵黃蛋白原還具有免疫防御功能。迄今為止甲殼類卵黃蛋白原的研究主要集中于十足目甲殼動(dòng)物，尚未發(fā)現(xiàn)口足目口蝦蛄卵黃蛋白原的研究，考慮到

5、卵黃蛋白原在繁殖發(fā)育中的重要作用，對口蝦蛄的卵黃蛋白原基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析顯得非常重要。 本實(shí)驗(yàn)利用 cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）首次成功克隆獲得口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg）基因的 cDNA 全長序列。且應(yīng)用相對實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)首次檢測口蝦蛄卵巢不同發(fā)育時(shí)期 Vg 基因的表達(dá)量。序列分析結(jié)果表明：Vg 基因全長 7727 bp（GenBank 登陸

6、號(hào)：KR422400） ，其中 5’端非編碼區(qū) 36 bp，開放閱讀框（ORF）7521 bp，3’端非編碼區(qū) 170 bp，共編碼 2506 個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,克隆所得口蝦蛄 Vg 基因和十足目蝦蟹類 Vg 基因親緣關(guān)系較近，符合甲殼動(dòng)物的最新分類系統(tǒng)。其開放閱讀框編碼的氨基酸序列和其他已知十足目卵黃蛋白原序列在 NCBI上進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對（BLASTP）存在 46%~52%的相似性，且含有 4 個(gè)已知功能結(jié)構(gòu)域：參與脂質(zhì)

7、轉(zhuǎn)運(yùn)的卵黃蛋白原 N 端結(jié)構(gòu)域（Vitellogenin_N）和脂蛋白（Lipoprotein）N 端結(jié)構(gòu)域（LPD_N） ，以及 2 個(gè)血管性血友病因子（von Willebrand factor）D 型結(jié)構(gòu)域（VWD） 。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析結(jié)果表明,口蝦蛄 Vg 基因的表達(dá)量隨著卵巢發(fā)育的進(jìn)程顯著升高 （P <0.05） ，在成熟期時(shí)達(dá)到最高值，隨后顯著下降（P <0.05） ，未發(fā)育期時(shí)的表達(dá)量最低。由此可知，