煙粉虱卵黃發(fā)生、卵黃蛋白及其受體基因序列的分析.pdf

1、科學(xué)家近年來的研究表明,B/Q型煙粉虱成功入侵的原因主要有以下幾種:一是生殖干涉,即非對稱性交配;二是感染雙生病毒,即與病毒的互利互惠;三是煙粉虱對化學(xué)殺蟲劑的抗性。但引起這些機(jī)制的生理和分子途徑尚不明確,因此,探討煙粉虱入侵的生理和分子機(jī)制,對于日后有效控制其為害具有深遠(yuǎn)意義。本研究主要從煙粉虱的生殖發(fā)育包括:卵巢形態(tài)及發(fā)育、精巢發(fā)育及卵子發(fā)生等為切入點,通過比較不同生物型煙粉虱卵巢內(nèi)不同發(fā)育級別卵子比例、卵子發(fā)生過程及卵黃發(fā)生動態(tài)等

2、的異同,分析引起不同生物型煙粉虱之間生殖差異的生殖基礎(chǔ),并通過克隆卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)及其受體(VitellogeninReceptor,VgR)基因,分析比較Vg基因序列和結(jié)構(gòu),以及檢測感染TYLCCNV病毒生物型煙粉虱轉(zhuǎn)錄水平的差異,探討入侵種煙粉虱成功入侵的生殖基礎(chǔ)與分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　 1、煙粉虱內(nèi)生殖系統(tǒng)形態(tài)和卵巢發(fā)育的比較分析
　　 B型煙粉虱雌蟲內(nèi)生殖系統(tǒng)主要由對稱的一對卵

3、巢、一個直徑約20μm的受精囊、側(cè)輸卵管和中輸卵管組成。B型煙粉虱卵巢管屬于端滋式發(fā)育模式,由12-22根卵巢管組成,可以根據(jù)發(fā)育時期將煙粉虱的卵巢分為四個不同階段。根據(jù)卵巢內(nèi)卵子形態(tài)和卵黃蛋白沉積的情況,可以把卵子分為四個級別,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級。B煙粉虱的精巢主要由一對對稱排列的睪丸、雄性附腺和輸精管組成。比較B型和ZHJ1型煙粉虱卵巢發(fā)育顯示,兩種生物型煙粉虱卵巢形態(tài)相似,以健康棉花為寄主植物時,生殖發(fā)育差異不顯著。
　　

4、 2、煙粉虱卵子發(fā)生和精子發(fā)生
　　 煙粉虱的卵子發(fā)生始于偽蛹期,在煙粉虱雌蟲開始形成卵巢時,卵原干細(xì)胞分別分化成滋養(yǎng)細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及濾泡細(xì)胞。紅眼期偽蛹已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有卵巢管,成蟲羽化后12h就觀察到有產(chǎn)卵行為,24h后解剖出含有成熟卵子的卵巢。48h解剖出帶有受精囊的卵巢。煙粉虱的卵子發(fā)生分為滋養(yǎng)期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期和成熟期四個時期。卵母細(xì)胞通過滋養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)輸和自身攝取兩種方式進(jìn)行Vg等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。煙粉虱的精子發(fā)生同樣

5、始于偽蛹期,精細(xì)胞先后經(jīng)歷精原細(xì)胞、初級精細(xì)胞、次級精細(xì)胞和成熟精細(xì)胞四個階段,不同階段的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也不同。
　　 3、煙粉虱Vg單克隆抗體和多克隆抗體的制備
　　 通過收集煙粉虱產(chǎn)的新鮮卵作為免疫抗原制備單克隆、多克隆抗體。經(jīng)小鼠脾細(xì)胞與可體外培養(yǎng)并繁殖的入骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行體外融合,利用ELISA篩選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)后用上清制備腹水,收集腹水經(jīng)純化后得到Vg的單克隆抗體.經(jīng)SDS-PAGE電泳,切取雌性特異性條帶,將回

6、收條帶電透析后濃縮制備抗原,皮下多點注射雄性白兔,爾后取靜脈血經(jīng)沉淀純化后獲得多克隆抗體.ELISA測定效價發(fā)現(xiàn),單抗效價為1:100,000,多抗的效價為1:68,000。Wertern-blot分析發(fā)現(xiàn)抗卵黃蛋白抗體能和幾種生物型煙粉虱卵黃蛋白及血淋巴中的雌性特異性蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng),但是不能與雄蟲提取物起特異性免疫反應(yīng).
　　 4、煙粉虱卵黃發(fā)生及Vg特性的分析
　　 利用凝膠層析和離子交換層析對煙粉虱卵黃蛋白(Ve

7、tellin,Vt)進(jìn)行了分離純化,利用非變性凝膠電泳和變性凝膠電泳分析卵黃蛋白分子組成發(fā)現(xiàn),卵黃蛋白是由兩個大小為190kDa相似亞基組成的分子量約380kDa的大分子蛋白。對煙粉虱’Vg性質(zhì)分析顯示,煙粉虱Vg是磷酸化糖基化脂蛋白。利用雙抗夾心ELISA對取食健康棉花的煙粉虱不同發(fā)育時期Vg含量檢測發(fā)現(xiàn),煙粉虱Vg合成始于偽蛹期,羽化后血淋巴中的Vg含量先下降后逐漸上升,卵巢中的Vt基本呈逐漸上升趨勢。
　　 5、煙粉虱Vg

8、基因的克隆及轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
　　 克隆獲得B型煙粉虱Vg基因cDNA全長序列為6731bp,開放閱讀框長度為6474bp,共編碼2158個氨基酸,預(yù)測分子量為242kDa,等電點為8.9,3'端非編碼區(qū)為220bp,5'端非編碼區(qū)為37bp。其中前16個氨基酸為信號肽,絲氨酸(S)占12.5％,天冬氨酸(N)占12.7％,谷氨酰胺(Q)8.9％。在490個氨基酸有一個RXXR酶切位點,將Vg基因切成編碼約50kDa和190kDa的

9、大小蛋白。序列相似性比對后發(fā)現(xiàn),煙粉虱Vg基因與玻璃葉蟬Homalodiscacoagulata的相似性為86.7％,與葉蜂Athaliarosae的相似性為85.6％,與大鱉負(fù)蝽Lethocerusdeyrollei的相似性為84.5％。利用熒光定量PCR(Q-PCR)技術(shù)檢測不同時期Vg基因轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn),羽化后煙粉虱Vg表達(dá)量呈逐漸升高趨勢.
　　 6、不同生物型煙粉虱Vg基因克隆及分析.
　　 ZHJ2型煙粉虱

10、Vg基因全長6721bp,開放閱讀框長度約6549bp,共編碼2183個氨基酸,預(yù)測分子量為245kDa，等電點為8.7,3'非編碼區(qū)為109bp,5'非編碼區(qū)為63bp。其中前22個氨基酸為信號肽,在450個氨基酸有一個RXXR酶切位點,將Vg基因切成編碼約50kDa和190kDa大小蛋白。絲氨酸(S)占12.5％,天冬氨酸(N)占13.5％,谷氨酰胺(Q)7.1％,丙氨酸(A)9.2％。序列相似性比對后發(fā)現(xiàn),ZHJ-2型煙粉虱Vg基

11、因與菜葉蜂Athaliarosae的相似性為93.9％,與大鱉負(fù)蝽Lethocerusdeyrollei的相似性為93.5％,與玻璃葉蟬Homalodiscacoagulate相似性為89.9％。
　　 Q型煙粉虱Vg基因全長6871bp,開放閱讀框長度約6651bp,共編碼2217個氨基酸,預(yù)測分子量為246kDa,等電點為8.9,3'非編碼區(qū)為107bp,5'非編碼區(qū)為43bp。其中前17個氨基酸為信號肽,在490和790個

12、氨基酸各有一個RXXR酶切位點,可能會將Vg基因切成編碼約50kDa、90kDa、150kDa或者190kDa大小蛋白。絲氨酸(S)占15％,天冬氨酸(N)占12.8％,谷氨酰胺(Q)6.2％,丙氨酸(A)9.2％。序列相似性比對后發(fā)現(xiàn),Q型煙粉虱Vg基因與菜葉蜂A.rosae的相似性較低,僅為63.4％,與大鱉負(fù)蝽L.deyrollei的相似性為57.3％,與玻璃葉蟬H.coagulata相似性為55.6％。
　　 對三種煙粉

13、虱Vg的核酸序列和氨基酸序列比較分析后發(fā)現(xiàn),入侵種B型/Q型與本地種ZHJ2型煙粉虱相比,在第620-640氨基酸序列間,均比.ZHJ2型煙粉虱多一段長度為15個氨基酸的多聚絲氨酸片段.而入侵種Q型與B型、本地種ZHJ2煙粉虱Vg基因序列相比,Q型煙粉虱具有兩個酶切位點,且在多聚絲氨酸區(qū)多9個重復(fù)的GHN功能結(jié)構(gòu)域。三個生物型煙粉虱Vg基因都具有卵黃蛋白典型的功能結(jié)構(gòu)域GCMG和NIIK,以及重復(fù)的多聚絲氨酸區(qū),與其它昆蟲Vg基因推導(dǎo)氨

14、基酸序列比較,煙粉虱Vg基因不僅含有多個多聚絲氨酸區(qū)域,且存在多聚天冬氨酸和谷氨酰胺區(qū),這在昆蟲卵黃蛋白基因序列結(jié)構(gòu)上是不多見的。有意思的是在煙粉虱Vg基因序列的氮端多聚絲氨酸區(qū)之前,都會出現(xiàn)多個重復(fù)的GH/RN功能結(jié)構(gòu)域,其功能還有待進(jìn)一步研究。
　　 7、煙粉虱Vg受體基因的克隆及表達(dá)分析
　　 克隆到B型煙粉虱Vg受體(VgReceptor,VgR)基因全長cDNA序列,大小5774bp,編碼1919個氨基酸,5'

15、端非編碼區(qū)201bp,等電點為8.7,分子量大小約201kDa,跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示,VgR跨膜結(jié)構(gòu)位于C-末端的1679-1696個氨基酸位置。煙粉虱的VgR屬于低密度脂蛋白受體(LowDensityLipoproteinReceptor,LDLR)家族,具有一些LDLR家族典型的保守結(jié)構(gòu)域,主要包括:配體結(jié)合域(Ligand-BindingDomain)、表皮生長因子前體同源域、跨膜域(TransmembraneDomain)、O-聯(lián)

16、糖功能域(O-linkedCarbohydrateDomain)及胞質(zhì)尾域(CytoplasmicDomain)。同源比對分析顯示,B型煙粉虱VgR同美洲大蠊.Periplanetaamericana相似度達(dá)83％,及德國小蠊Blattellagermanica相似度達(dá)74％,并利用同源建模方法構(gòu)建了VgR編碼蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu).同時用熒光定量PCR(Q-PCR)技術(shù)檢測分析了B型煙粉虱Vg受體基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　 8、感染TY

17、LCCNV病毒對煙粉虱生殖力及Vg、VgR基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響
　　 對羽化后15d內(nèi)的B型煙粉虱雌蟲卵巢發(fā)育進(jìn)度觀察發(fā)現(xiàn),初羽化的雌蟲已經(jīng)開始卵巢發(fā)育,在卵巢內(nèi)未見成熟的卵子.羽化后2d發(fā)現(xiàn)有卵黃沉積的卵子,發(fā)育3-4d的卵巢內(nèi)觀察到成熟卵子,且隨著發(fā)育時間的延長,卵巢內(nèi)成熟卵子數(shù)目逐漸增多,至羽化后11-14d卵巢內(nèi)成熟卵子數(shù)目達(dá)到最大。煙粉虱卵巢中的卵子在形態(tài)上分為四個級別,分別標(biāo)記為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級,其中Ⅳ級為成熟卵

18、。煙粉虱卵巢時期和卵子發(fā)育級別的劃分為評價煙粉虱生殖力奠定了基礎(chǔ)。比較B型/ZHJ1型煙粉虱取食感染中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)煙草植株與在健康煙草植株上取食2種條件下的卵巢發(fā)育進(jìn)度結(jié)果表明,B型煙粉虱在患病植株上取食,卵子發(fā)育進(jìn)度加快,表現(xiàn)在不同發(fā)育時間Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級卵子數(shù)目顯著高于取食未感毒煙草的煙粉虱。然而,觀察發(fā)現(xiàn)TYLCCNV對土著ZHJ1型煙粉虱卵巢內(nèi)卵子發(fā)育進(jìn)度卻無顯著影響。提取同期煙粉虱總RNA,并分別考察了取食