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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)合成過程是一個(gè)開放的系統(tǒng),其中多種因子與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成過程,維持細(xì)胞內(nèi)所有生命過程的有序進(jìn)行,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)有一系列蛋白質(zhì)包括一些酶參與蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié),形成了復(fù)雜的mRNA代謝和蛋白質(zhì)合成的網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。酵母雙雜交文庫是篩選與目的蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的一種非常有效的方法。利用該方法已經(jīng)篩選得到了許多相互作用的目的蛋白質(zhì),為研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了極為有效的工具。
蛋白質(zhì)
2、的合成過程包括核糖體上肽鏈合成的起始、延伸和新生肽鏈的釋放。肽鏈釋放因子不僅在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成終止過程中起作用,而且在其它方面也起到重要作用,表現(xiàn)出多功能蛋白質(zhì)的特征。
原生動物八肋游仆蟲是一類單細(xì)胞真核生物,其密碼子使用存在特殊性:終止密碼子UGA在該生物體中編碼半胱氨酸。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道纖毛蟲中八肋游仆蟲的閱讀框中終止密碼子(UGA)出現(xiàn)的頻率最低,其mRNA最有效的被翻譯成了高分子量的連續(xù)的多肽鏈,這一結(jié)果為首次纖毛蟲酵母
3、雙雜交文庫的構(gòu)建提供了重要依據(jù)。
本研究以八肋游仆蟲為材料,提取總RNA,用mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA構(gòu)建酵母雙雜交文庫,用蛋白質(zhì)合成終止過程中負(fù)責(zé)新生肽鏈釋放的兩類肽鏈釋放因子作為誘餌蛋白,篩選與其相互作用的蛋白質(zhì),獲得了以下主要結(jié)果:
提取了八肋游仆蟲總RNA,瓊脂糖凝膠電泳中28S rRNA條帶顯示得到了較為理想的提取物;利用clontech公司的BD MatchmakerTM Library Contruc
4、tion&Screening kit試劑盒,將得到的總RNA中的mRNA利用兩步法合成ds cDNA,通過純化、富集、再純化得到了與對照相比豐度比較適合的cDNA;用PCR方法對得到的cDNA進(jìn)行了鑒定,結(jié)果擴(kuò)增到已知的基因。將得到的cDNA與用SmaⅠ單酶切處理的文庫質(zhì)粒pGADT7-Rec混合,轉(zhuǎn)化接合酵母菌AH109,涂板培養(yǎng),收集克隆;最后分析文庫滴度為2.437×107cfu/mL,文庫構(gòu)建基本完成,隨后隨機(jī)提取文庫中的質(zhì)粒,
5、用質(zhì)粒pGADT7-Rec上的測序引物進(jìn)行測序分析,證明在質(zhì)粒中重組了八肋游仆蟲的基因片段。
以蛋白質(zhì)合成終止過程中的兩類肽鏈釋放因子之一eRF3作為誘餌蛋白基因,利用酵母雙雜交的方法從游仆蟲cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白基因相互作用的蛋白基因。獲得以下結(jié)果:1)構(gòu)建了含誘餌蛋白基因的重組質(zhì)粒pGBKT7-eRF3,將其轉(zhuǎn)化到接合菌Y187中,對Y187/pGBKT7-eRF3菌株進(jìn)行了鑒定,提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行擴(kuò)增,將得
6、到的質(zhì)粒進(jìn)行分析和測序,結(jié)果表明成功構(gòu)建了含有融合誘餌蛋白重組基因的目的菌株;2)文庫菌和誘餌菌雜交,接合率大于2%;將接合后的菌液涂于SD/-Leu/-Trp/-His平板上進(jìn)行初級篩選,獲得了200個(gè)陽性克隆;再將初級篩選得到的克隆涂于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性篩選,獲得了36個(gè)克隆;重復(fù)嚴(yán)謹(jǐn)性篩選后得到22個(gè)克隆;最后用β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行鑒定,獲得16個(gè)陽性克隆,一系列的篩選總率為8%。3)將
7、篩選出的陽性菌落提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用獲得的高拷貝質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。測序結(jié)果表明,16個(gè)質(zhì)粒中6號和74號質(zhì)粒含有較長的未知基因閱讀框核酸序列;BLAST比對結(jié)果顯示33號和105號與游仆蟲核糖體RNA的序列類似;其余測序結(jié)果與這四個(gè)序列基本相同。4)酵母雙雜交重復(fù)鑒定實(shí)驗(yàn)表明6號是陽性結(jié)果,說明其編碼的蛋白質(zhì)在體內(nèi)與誘餌蛋白eRF3相互作用;74號結(jié)果呈陰性,需要再做體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。5)根據(jù)6號質(zhì)粒的測序結(jié)果設(shè)
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