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1、中心蛋白是一種分子量約為20 kD的酸性蛋白,屬于高度保守的鈣調(diào)蛋白EF-hand超家族,廣泛存在于多種生物體,如酵母、藻類、原生動(dòng)物、高等植物和哺乳動(dòng)物等的中心體(基體或紡錘極體)中,參與中心體的復(fù)制與分離、纖維的收縮和鞭毛切除等過程。
八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)由兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域(N端和C端)組成,每端包含兩個(gè)EF-手結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。為了研究八肋游仆蟲中心蛋白N端loop區(qū)首個(gè)氨基酸的生物功能,我們通過
2、分子生物學(xué)方法構(gòu)建了N端半分子的突變體N-D37K和N-D73K(D是天冬氨酸,K是賴氨酸)。
首先利用PCR技術(shù),在全分子突變體D37K的基礎(chǔ)上通過截短構(gòu)建得到了N端突變體N-D37K,然后通過定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建得到了另一個(gè)N端突變體N-D73K。DNA序列測(cè)定表明所得突變體只有目的位點(diǎn)的基因發(fā)生突變,而無(wú)其他任何位點(diǎn)的隨機(jī)突變。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,在誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達(dá)。融
3、合蛋白通過PPase酶切和GST親和層析后得到純的目的蛋白。同時(shí)將野生型蛋白(EoCen)和課題組之前構(gòu)建完成的N端野生型蛋白(N-EoCen)誘導(dǎo)表達(dá)純化得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示,所得蛋白均不含雜蛋白條帶,達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的純度。
本文運(yùn)用熒光、電泳和電化學(xué)等方法研究了中心蛋白N端及其突變體與金屬離子(Ca2+/Tb3+)的結(jié)合性質(zhì)。鋱離子熒光敏化實(shí)驗(yàn)和共振光散射實(shí)驗(yàn)證明,N-D73K可以結(jié)合兩個(gè)Tb3+,這與N
4、端野生型N-EoCen一致,而N-D37K只能結(jié)合一個(gè)Tb3+。同時(shí),我們得到了Tb3+與中心蛋白Ⅱ部位的結(jié)合常數(shù)KⅡ-Tb=(8.31±0.18)×104 M-1。通過Ca2+與Tb3+競(jìng)爭(zhēng)N-D37K的結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn),我們得到了Ca2+與中心蛋白Ⅱ部位之間的結(jié)合常數(shù)KⅡ-Ca=(0.94±0.12)×102 M-1。用TNS作為疏水探針,我們研究了中心蛋白N端及其突變體結(jié)合金屬離子后的構(gòu)象變化,與N-EoCen、N-D73K相比,N
5、-D37K的構(gòu)象幾乎不發(fā)生變化,同時(shí)得到了TNS與Tb3+飽和的N-EoCen和N-D37K的結(jié)合常數(shù),K(Tb3+-N-D37K-TNS)=(6.57±0.89)×106 M-1和K(Tb3+-N-EoCen-TNS)=(9.35±0.05)×105 M-1。通過共振光散射實(shí)驗(yàn)和化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn),我們對(duì)N-EoCen、N-D73K、N-D37K的聚集性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn):與N-EoCen、N-D73K相比,N-D37K幾乎不聚集。另外,我們還對(duì)
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