肌球蛋白輕鏈激酶cDNA克隆及其CaM結(jié)合位點(diǎn)突變體的構(gòu)建.pdf

1、目的:
　　 肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkianse，MLCK)是平滑肌收縮過(guò)程中的關(guān)鍵酶。當(dāng)平滑肌細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，MLCK可以通過(guò)與Ca2+/CaM復(fù)合物相結(jié)合，磷酸化肌球蛋白20KD的調(diào)節(jié)輕鏈(regulatorylightchain，RLC)，從而激活肌球蛋白ATP酶的活性，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的相互作用，促進(jìn)平滑肌的收縮，這是MLCK調(diào)節(jié)平滑肌收縮的經(jīng)典激酶調(diào)節(jié)機(jī)制。M

2、LCK除了具有激酶活性之外，還具有與肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白相結(jié)合的非激酶活性。此外，MLCK對(duì)細(xì)胞的遷移以及細(xì)胞骨架的重組也發(fā)揮著重要的作用。為了研究MLCK的非激酶活性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞骨架的影響，本實(shí)驗(yàn)利用PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建了牛胃重組全長(zhǎng)MLCK真核表達(dá)載體，并且以此為基礎(chǔ)，對(duì)牛胃重組全長(zhǎng)MLCK的1002-1022氨基酸（即CaM結(jié)合位點(diǎn)）進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)突變?cè)撕驼婧吮磉_(dá)載體，為深入研究MLCK的非激酶活性對(duì)平滑

3、肌細(xì)胞收縮遷移的影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)以構(gòu)建的MLCK全長(zhǎng)原核表達(dá)載體pCold-MLCK為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物中加入NheⅠ酶切位點(diǎn)和Flag標(biāo)簽序列(DYKDDDDK)，F(xiàn)lag標(biāo)簽位于MLCK的N端，該標(biāo)簽抗體可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染的成功與否以及轉(zhuǎn)染效率。以pCold-MLCK質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得533bp目的片段。用NheⅠ/KpnⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒

4、，獲得144bp目的片段和5.4kb的載體片段，將二者相連接得到pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒。再用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-MLCK質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，分別獲得3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得重組的pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒。(2)根據(jù)CaM的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR引物，在上游和下游引物中分別加入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，以pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒為模板

5、進(jìn)行PCR。用NheⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得700bp的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得亞克隆質(zhì)粒pcDNA-MLCK700。針對(duì)CaM結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，使MLCKcDNA序列中的T3016、G3017突變?yōu)镚3016、C3017。以亞克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR突變，獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的亞克隆突變體pcDNA-MLCK700-CaM。用NcoⅠ分別酶切pcDNA-MLCK7

6、00-CaM質(zhì)粒和pCold-MLCK質(zhì)粒，獲得556bp目的片段和7.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的原核表達(dá)突變體pCold-M-CaM質(zhì)粒。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-M-CaM質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒，分別得到3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的真核表達(dá)載體pcDNA-F-M-CaM。
　　 結(jié)果:
　　 (1)

7、以質(zhì)粒pCold-MLCK為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到一條533bp目的片段，該片段大小與預(yù)期一致。用NheⅠ和KpnⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，分別得到144bp的目的片段和5.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。再用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-MLCK質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，分別獲得3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段

8、，用連接酶將二者相連接獲得重組的pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。(2)以質(zhì)粒pCold-MLCK為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到一條700bp目的片段，該片段包含CaM結(jié)合位點(diǎn)。用NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，分別得到700bp的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得亞克隆質(zhì)粒pcDNA-MLCK700，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。針對(duì)CaM結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，以亞克

9、隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR突變，獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的亞克隆突變體pcDNA-MLCK700-CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。用NcoⅠ單酶切pcDNA-MLCK700-CaM質(zhì)粒和pCold-MLCK質(zhì)粒，分別獲得556bp目的片段和7.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的原核表達(dá)突變體pCold-M-CaM質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-M-CaM質(zhì)粒和pcDNA-

10、F-MLCK質(zhì)粒，分別得到3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)的真核表達(dá)載體pcDNA-F-M-CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。
　　 結(jié)論:
　　 (1)通過(guò)DNA序列測(cè)定及分析結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功地構(gòu)建了MLCK重組野生型真核表達(dá)載體pcDNA-F-MLCK。(2)通過(guò)定點(diǎn)突變的方法獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)突變的原核表達(dá)載體pCold-M-CaM，該質(zhì)?？捎糜谠吮磉_(dá)，