家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈基因特性研究.pdf

1、肌球蛋白作為細胞骨架的分子馬達，主要存在于骨骼肌中，其家族成員龐大，依據(jù)其來源可分為經(jīng)典的肌球蛋白和非經(jīng)典的肌球蛋白。肌球蛋白分子外形如芽菜狀，由多條重鏈與多條輕鏈構(gòu)成。肌球蛋白Ⅱ是目前研究中最為廣泛的一類蛋白。家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈（Bombyx mori MyosinⅡessential light chain,BmMyosinⅡELC）的功能研究較少。家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈基因全長為1086bp，開放閱讀框為444 bp，編碼的蛋

2、白大小為16 kDa。家蠶肌球蛋白Ⅱ的的研究甚少，但在其他物種中，尤其是哺乳動物中，肌球蛋白磷酸化后在細胞遷移，細胞收縮，以及調(diào)控細胞的形態(tài)與凋亡等方面有著至關(guān)重要的作用。本研究中主要從生物信息學預(yù)測，選擇性壓力分析，家蠶肌球蛋白對細胞遷移方面的影響，轉(zhuǎn)錄時相，表達時相以及蛋白互作等方面展開，為后續(xù)繼續(xù)研究家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈提供了基礎(chǔ)，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學預(yù)測分析表明，家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈開放閱讀框為44

3、4bp，蛋白大小為16 kDa，等電點為4.49。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提取出的28條相似序列中，經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)都包含有EFh結(jié)構(gòu)域，此位點中包含著Ca2+的結(jié)合區(qū)域。通過NJ進化樹分析發(fā)現(xiàn)，家蠶肌球蛋白與帕眼蝶肌球蛋白相似性最高。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，家蠶肌球蛋白主要在細胞質(zhì)中分布，而且沒有檢測到跨膜區(qū)域的存在。選擇性壓力分析表明，28條序列在進化過程中都未發(fā)現(xiàn)存在有正向選擇位點，Ka/Ks值全部小于1，說明肌球蛋白在進化過程中較為保守

4、。
　　(2)利用原核表達系統(tǒng)對家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈基因進行克隆，并對家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈蛋白大量誘導(dǎo)表達，分離純化后免疫小鼠，得到家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈的多克隆抗體，經(jīng)過驗證多克隆抗體的特異性與效價后基本可以滿足后續(xù)實驗的要求。
　　(3)為了探究家蠶肌球蛋白與哺乳動物肌球蛋白功能特性的區(qū)別，我們構(gòu)建了不同的載體轉(zhuǎn)染相應(yīng)的細胞系。細胞創(chuàng)傷實驗結(jié)果表明，家蠶肌球蛋白與哺乳動物肌球蛋白功能相類似，同樣可以促進細胞遷移。

5、r>　　(4)不同品系家蠶(306，NB，BC8)在受到家蠶核型多角體病毒(Bombyxmori nueleopolyhedrovirus，BmNPV)的影響后，轉(zhuǎn)錄時相分析表明，易感BmNPV306品系中家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈基因在12h與其他時間點相比轉(zhuǎn)錄水平明顯增高。三種品系相比，抗性品系轉(zhuǎn)錄水平明顯高于易感型品系;從表達水平來看，出現(xiàn)了相反的結(jié)果，抗性品系家蠶肌球蛋白Ⅱ必需輕鏈表達反而低于易感型家蠶，其原因并不清楚。