游仆蟲第一類肽鏈釋放因子N、C結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能分析.pdf

1、在蛋白質(zhì)合成的過程中，當(dāng)三個(gè)終止密碼子UAA、UAG或UGA中的任意一個(gè)出現(xiàn)時(shí)，蛋白質(zhì)合成即終止。終止密碼子是由第一類肽鏈釋放因子識(shí)別的。在真核生物中，eRF1可以識(shí)別三個(gè)終止密碼子，并催化新生肽鏈與位于核糖體P-位點(diǎn)的tRNA之間的酯鍵水解，釋放新生肽鏈。隨后，eRF3促使eRF1從核糖體上脫離。
　　絕大多數(shù)真核生物只有一種第一類肽鏈釋放因子eRF1，真核生物的eRF1在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上極為相似，人的第一類肽鏈釋放因子eRF1

2、在晶體結(jié)構(gòu)和溶液中都包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域（N，M和C結(jié)構(gòu)域）。N結(jié)構(gòu)域在核糖體A位點(diǎn)識(shí)別終止密碼子，M結(jié)構(gòu)域與肽酰轉(zhuǎn)移酶中心相互作用，通過高度保守的GGQ模塊對(duì)肽酰-tRNA的酯鍵進(jìn)行親核進(jìn)攻，使酯鍵水解釋放新生肽鏈，C結(jié)構(gòu)域則是與第二類肽鏈釋放因子eRF3結(jié)合的主要區(qū)域。兩類肽鏈釋放因子都是終止過程中的關(guān)鍵因子，在終止密碼子的識(shí)別過程中eRF3與eRF1耦合成為翻譯過程的校讀因子，并有效地完成新生肽鏈的釋放過程。
　　有些生物偏離了遺

3、傳密碼體系稱為遺傳密碼變異生物（variant code organisms），例如:纖毛蟲中的游仆蟲和赭纖蟲都是遺傳密碼發(fā)生變異的生物，使用UAA和UAG作為終止密碼子，而將UGA重新解碼為有義密碼子，UGA在八肋游仆蟲（Euplotesoctocarinatus）中被重新解碼為半胱氨酸，而在日本赭纖蟲(Blepharisma japonicum)中UGA則被重新解碼為色氨酸。遺傳密碼變異生物的eRF1與標(biāo)準(zhǔn)遺傳編碼生物(standa

4、rd code organisms)的eRF1高度同源，而局部的不同可能正是導(dǎo)致功能差異的原因。這些在標(biāo)準(zhǔn)遺傳編碼生物中高度保守，而在遺傳密碼變異生物中保守性降低的模體可能正是密碼子識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　與大多數(shù)真核生物不同，八肋游仆蟲中有兩種第一類肽鏈釋放因子，分別為Eo-eRF1a和Eo-eRF1b。Eo-eRF1b基因的閱讀框中有三個(gè)終止密碼子UGA，將其突變?yōu)橛辛x密碼子才能在體外表達(dá)。本研究將Eo-eRF1b基因閱讀框中的

5、三個(gè)終止密碼子UGA突變?yōu)榘腚装彼崦艽a子，并分別對(duì)八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子（Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）以及日本赭纖蟲第一類肽鏈釋放因子(Bj-eRF1)的N、C結(jié)構(gòu)域及全長(zhǎng)蛋白進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化和鑒定。Eo-eRF3Cm6為八肋游仆蟲第二類肽鏈釋放因子Eo-eRF3的一種截短肽，本課題組前期工作已證明Eo-eRF3Cm6是八肋游仆蟲第二類肽鏈釋放因子Eo-eRF3與八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子Eo-eRF1a相互作用的

6、最短肽，本研究利用體外pulldown實(shí)驗(yàn)證明兩種纖毛蟲第一類肽鏈釋放因子及其C結(jié)構(gòu)域都可以與Eo-eRF3Cm6結(jié)合形成復(fù)合物。
　　大多數(shù)蛋白都有發(fā)色基團(tuán)，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的變化可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。本研究中的兩種纖毛蟲第一類肽鏈釋放因子（Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）的N、C結(jié)構(gòu)域上各含有一個(gè)高度保守的色氨酸，熒光光譜結(jié)果表明，N結(jié)構(gòu)域上的色氨酸所處的微環(huán)境較為親水，而C結(jié)構(gòu)域上的色氨酸所處的微環(huán)

7、境較為疏水。當(dāng)與Eo-eRF3Cm6結(jié)合形成復(fù)合物， Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移（從340 nm藍(lán)移到330 nm），表明第一類肽鏈釋放因子的構(gòu)象發(fā)生了變化。eRF1-eRF3相互作用的部位在eRF1C結(jié)構(gòu)域上，Eo-eRF3Cm6與eRF1的C結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，Eo-eRF1 a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C結(jié)構(gòu)域的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒有發(fā)生藍(lán)移。通過對(duì)熒光淬滅光譜的分析，結(jié)果表明:與Eo-

8、eRF3Cm6結(jié)合以后，eRF1及其C結(jié)構(gòu)域的淬滅常數(shù)和可淬滅分?jǐn)?shù)都有不同程度的降低，表明其上色氨酸的微環(huán)境轉(zhuǎn)為疏水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，與Eo-eRF3Cm6結(jié)合后，eRF1最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移是由于eRF1上N、C結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生了相互作用。
　　為了更深入地對(duì)eRF1-eRF3相互作用進(jìn)行分析，我們對(duì)八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子（Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）以及日本赭纖蟲第一類肽鏈釋放因子(Bj-eRF1)的N、C結(jié)構(gòu)域進(jìn)行

9、了基于同源建模的計(jì)算機(jī)模擬分析并對(duì)C結(jié)構(gòu)域上與eRF1-eRF3相互作用的可能位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　對(duì)C結(jié)構(gòu)域的模擬表明，Eo-eRF1a/bC結(jié)構(gòu)域上高度保守的位點(diǎn)I290和D293（Bj-eRF1中為V294和D297）以及高度保守的GVEDT和GFGG模體直接參與eRF1-eRF3相互作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)eRF1上保守位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，用Eo-eRF3Cm6誘餌蛋白與突變蛋白進(jìn)行體外pulldown和Western blot

10、ting檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以評(píng)估突變位點(diǎn)對(duì)eRF1-eRF3相互作用的貢獻(xiàn)，以及發(fā)生作用的主要方式。Bj-eRF1中的V294在其他物種中為Ile，當(dāng)把V294回復(fù)突變?yōu)镮le，對(duì)Bj-eRF1與Eo-eRF3Cm6的相互作用影響不大，但是當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)锳la，Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b與Eo-eRF3Cm6的結(jié)合能力都大為下降。因此Eo-eRF1 a/bC結(jié)構(gòu)域上I290(Bj-eRF1中為V294)是eRF1C

11、與Eo-eRF3Cm6相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)上側(cè)鏈殘基的位阻作用對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定是十分重要的。另一個(gè)保守位點(diǎn)是Asp（Eo-eRF1a/b中為D293，Bj-eRF1中為D297），計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果表明，在三個(gè)eRF1C/Eo-eRF3Cm6復(fù)合物中，Asp都是形成氫鍵的位點(diǎn)。對(duì)這個(gè)保守位點(diǎn)的定點(diǎn)突變表明，在復(fù)合物Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6以及Bj-eRF1C/Eo-eRF3Cm6中，保守位點(diǎn)D293上靜電相互作用和氫鍵

12、締合對(duì)形成復(fù)合物的影響較大。但在Eo-eRF1 aC/Eo-eRF3 Cm6的復(fù)合物中，且該位點(diǎn)上靜電相互作用與氫鍵締合作用對(duì)形成復(fù)合物的影響比較小。當(dāng)將這一位點(diǎn)突變?yōu)锳la時(shí)，突變蛋白與Eo-eRF3Cm6的結(jié)合能力也大大降低。此外，對(duì)模擬結(jié)果中Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C結(jié)構(gòu)域與Eo-eRF3Cm6相結(jié)合前后的體系的總靜電相互作用能和非鍵相互作用能的變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明Eo-eRF1 a/Eo-eRF3C

13、m6復(fù)合物中靜電相互作用能比Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6復(fù)合物和Bj-eRF1C/Eo-eRF3 Cm6復(fù)合物中靜電相互作用能大。在不同的鹽濃度下對(duì)復(fù)合物進(jìn)行共振光散射光譜研究，結(jié)果表明Eo-eRF1a/Eo-eRF3Cm6復(fù)合物對(duì)鹽濃度更為敏感。從上面的結(jié)果可以看出，在與Eo-eRF3Cm6相互作用的過程中Eo-eRF1b和Bj-eRF1C結(jié)構(gòu)域的行為比較接近，而Eo-eRF1 aC結(jié)構(gòu)域則與前兩者存在差異，表明在與Eo-

14、eRF3Cm6相互作用的過程中Eo-eRF1a可能選擇了不同于Eo-eRF1b的方式。
　　對(duì)eRF1 N結(jié)構(gòu)域突變體的構(gòu)象進(jìn)行模擬，并結(jié)合其生物功能的變化對(duì)eRF1 N結(jié)構(gòu)域識(shí)別密碼子的功能進(jìn)行分析。盡管突變位點(diǎn)的靜電作用能和氫鍵發(fā)生了明顯的變化，但是與eRF1識(shí)別密碼子功能的回復(fù)并沒有明顯的相關(guān)性。值得注意的是在TASNIKS模塊和eRF1C結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)構(gòu)象靈活的loop(95-103)，推測(cè)這個(gè)loop可能與密碼子的識(shí)別