PRDM16C2C12細(xì)胞分化的影響及其PR結(jié)構(gòu)域的功能分析.pdf

1、成肌細(xì)胞具有多種分化潛能，除了可以定向分化為肌纖維外，還可以被誘導(dǎo)進(jìn)入成脂分化。成肌細(xì)胞進(jìn)行成脂分化，在肌肉組織中異位沉積脂肪形成肌內(nèi)脂肪，通常與機(jī)體代謝紊亂綜合癥的發(fā)生有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)具有棕色脂肪代謝活性的細(xì)胞零散分布于肌內(nèi)脂肪中，其數(shù)量與機(jī)體的抗肥胖能力顯著相關(guān)。因此研究成肌細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)理對(duì)機(jī)體健康具有積極意義。
　　 棕色脂肪特異性因子PRDM16((P)ositive(R)egulatory(D)o

2、mainzinc finger protein(1)(6))，又稱PRDI-BF1-RIZ1((P)ositive(R)egulatory(D)omain(I)-(B)inding(F)actor(1) and(R)etinoblastoma-(I)nteracting(Z)inc finger factor-(1))通常被認(rèn)為是決定肌肉和棕色脂肪細(xì)胞共同的前體細(xì)胞（中胚層Myf5+/+前體細(xì)胞）肌肉/棕色脂肪細(xì)胞分化的“開關(guān)”。異位表

3、達(dá)PRDM16的成肌細(xì)胞成肌分化受到抑制，在生脂培養(yǎng)基中可以被誘導(dǎo)分化為棕色脂肪細(xì)胞，但目前PRDM16抑制成肌分化，促進(jìn)棕色脂肪分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明了。
　　 1 PRDM16對(duì)生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄及其啟動(dòng)子/增強(qiáng)子DNA甲基化的影響
　　 DNA甲基化是細(xì)胞分化過程中調(diào)控組織特異性基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制之一，因此本實(shí)驗(yàn)通過攜帶Flag-PRDM16的鼠干細(xì)胞病毒（(M)urine(S)tem(C)ell(V)irus，

4、MSCV）轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖期的C2C12成肌細(xì)胞，抗性篩選穩(wěn)定克隆，通過SEQUENOM檢測(cè)了肌肉特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋（(b)asic(H)elix-(L)oop-(H)elix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族生肌調(diào)節(jié)因子（(M)yogenic(R)egulatory(F)actors，(M)RFs）和生脂因子過氧化物酶體增殖激活受體γ（(P)eroxisome(P)roliferator(A)ctivating(R)eceptor-(γ)，PPA

5、Rγ）啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域DNA甲基化程度的改變。
　　 結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)PRDM16對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的增殖能力沒有顯著影響，顯著降低了C2C12分化為肌管的能力，表現(xiàn)為在生肌培養(yǎng)基（含2％馬血清）中孵育4天，肌管的標(biāo)志分子肌球蛋白重鏈（(M)yosin(H)eavy(C)hain，MyHC）、肌肉型肌酸激酶((M)uscle-type(C)reatine(K)inase, MCK)以及MRFs(MyoD, Myf5,

6、myogenin, MRF4)mRNA的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，表明轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源PRDM16是具有生物功能的，有效抑制了C2C12細(xì)胞的成肌分化。
　　 為了避免生肌/生脂培養(yǎng)基對(duì)生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄的干擾，我們采用自然分化培養(yǎng)基（即正常的生長培養(yǎng)基，含10％ FBS）誘導(dǎo)細(xì)胞分化。4天后，穩(wěn)定表達(dá)PRDM16的C2C12細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）的沉積升高了近一倍(P＜0.05)，同時(shí)生脂因子PPAR

7、γ、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α((C)CAAT/(E)nhancer(B)inding(P)rotein-(α)，C/EBPα)的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P＜0.05)。PRDM16同樣降低了自然分化條件下C2C12融合成肌管的能力，生肌因子MRFs及MyHC的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。結(jié)果表明PRDM16抑制C2C12細(xì)胞成肌分化，促進(jìn)成脂分化，并且PRDM16改變C2C12的分化方向主要是通過改變生肌/生脂因子的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。<

8、br>　　 在未分化的C2C12成肌細(xì)胞中，PRDM16顯著降低了除MyoD以外的其他生肌因子的轉(zhuǎn)錄水平，PPARγ mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，提示PRDM16削弱了C2C12向肌纖維分化的潛力，增強(qiáng)了其向脂肪分化的潛能，使C2C12成肌細(xì)胞具有了“棕色前體細(xì)胞”的某些潛質(zhì)。對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，通過SEQUENOM檢測(cè)以上生肌因子及PPARγ啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域的脫氧核糖核酸（(d)eoxyribo(n)u

9、cleic(a)cid，DNA）甲基化水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)PRDM16顯著增高了MyoD核心增強(qiáng)子、第一外顯子區(qū)域以及myogenin啟動(dòng)子DNA的甲基化程度，降低了Myf5最小啟動(dòng)子區(qū)域部分CpG位點(diǎn)的甲基化水平。而MRF4、PPARγ啟動(dòng)子DNA甲基化沒有顯著改變。
　　 2 PR結(jié)構(gòu)域缺失對(duì)PRDM16生物功能的影響
　　 PR結(jié)構(gòu)域（(P)ositive(R)egulatory domain）是PRDM蛋白家族的特

10、征性結(jié)構(gòu)之一，PR結(jié)構(gòu)域?qū)RDM16調(diào)控生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄的影響目前尚未見報(bào)道。為了分析PR結(jié)構(gòu)域的功能，我們進(jìn)一步構(gòu)建了PR結(jié)構(gòu)域缺失（PRDM16-ΔPR）的質(zhì)粒，篩選穩(wěn)定克隆，研究PR結(jié)構(gòu)域缺失對(duì)PRDM16生物功能的影響。
　　 與野生型PRDM16相比，PRDM16-ΔPR削弱C2C12生肌能力的作用更加明顯，表現(xiàn)為肌纖維標(biāo)志性分子MyHC、MCK的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，同時(shí)MyoD的表達(dá)顯著下降(P＜0.0

11、5)。PRDM16-ΔPR顯著削弱了PRDM16升高細(xì)胞內(nèi)TG以及激活PPARγ轉(zhuǎn)錄的作用(P＜0.05)。MyoD和PPARγ轉(zhuǎn)錄被PRDM16-ΔPR抑制，伴隨啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的改變。染色質(zhì)免疫沉淀分析（(C)hromatin(I)mmunoprecipitation，ChIP）顯示，PRDM16-ΔPR顯著升高了MyoD的啟動(dòng)子區(qū)域H3乙酰化、H3K9me3和H3K27me3的富集程度(P＜0.05);PRDM16-ΔPR顯著