miR143、miR145對C2C12細(xì)胞分化的影響作用研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長度約為21nt的非編碼小分子RNA，通過與靶基因3'-UTR區(qū)域結(jié)合從而對靶基因起抑制作用或?qū)ζ渲苯咏到狻iRNA雖然數(shù)量很少，卻參與了大量的生物學(xué)過程，例如細(xì)胞的生長與凋亡、癌細(xì)胞的增殖、組織與神經(jīng)分化、細(xì)胞代謝、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化等。骨骼肌作為動物機(jī)體上最大的組織，其發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，除了受到許多成生肌調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)外，表觀遺傳因素也對骨骼肌的發(fā)育起著重要遺傳調(diào)控作用，如miRNA

2、對mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路廣泛參與對許多生物學(xué)過程的調(diào)控，包括癌細(xì)胞的發(fā)育、纖維化、成骨分化等等。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路還參與調(diào)控骨骼肌的發(fā)育過程，并且對不同肌纖維類型的分化形成也具有調(diào)控作用。而Wnt信號通路在行使其生物學(xué)功能的過程中，同樣會受到許多miRNA的調(diào)控。
　　本實(shí)驗(yàn)以C2C12細(xì)胞為模型，通過miRNA mimic和inhibitor分別實(shí)現(xiàn)

3、miR143和miR145的高表達(dá)和抑制，重點(diǎn)研究miR143和miR145通過Wnt/β-catenin信號通路影響C2C12細(xì)胞分化的生物學(xué)機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.在正常分化的C2C12細(xì)胞中，miR143和miR145表達(dá)量隨著細(xì)胞分化過程的進(jìn)行逐漸升高。
　　2.在C2C12細(xì)胞分化第4天之后，高表達(dá)與低表達(dá)miR143和miR145都會使MyoD和MyoG的表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)。整個(gè)分化過程中mi

4、R143對Myf5的影響不顯著(P＞0.05)，而過表達(dá)或低表達(dá)miR145都會使Myf5的表達(dá)水平極顯著升高(P＜0.01)。在細(xì)胞分化中期（第4天到第6天），MRF4會受到過表達(dá)miR143和miR145的影響，而低表達(dá)miR143和miR145對MRF4的影響不顯著（P＞0.05）。過表達(dá)miR143和miR145會抑制成肌分化的標(biāo)志基因MyHC和ACTA1的表達(dá)，而低表達(dá)miR145時(shí)會顯著抑制MyHC的表達(dá)(P＜0.01)。以

5、上結(jié)果表明miR143和miR145參與對C2C12細(xì)胞分化過程的調(diào)控作用，但調(diào)控調(diào)控的作用存在差異。
　　3.miR143能顯著抑制4種肌纖維類型的表達(dá)，而且主要作用于Ⅱ型肌纖維。在細(xì)胞分化末期miR145不論高表達(dá)還是低表達(dá)都會顯著抑制4種肌纖維的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明miR143會抑制肌細(xì)胞分化過程的肌纖維類型分化，而過表達(dá)與低表達(dá)miR145主要抑制MyHCⅠ和MyHCⅡa的表達(dá)水平。
　　4.miR143和miR1

6、45對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控主要在細(xì)胞分化中期（第2到第6天），過表達(dá)與低表達(dá)miR143和miR145都會極顯著提高通路主要信號基因Axin2、LRP5和β-catenin的表達(dá)水平(P＜0.01)，但兩個(gè)miRNA的調(diào)控作用有差異性。非經(jīng)典Wnt信號通路的激活蛋白Wnt5a在過表達(dá)miR143和miR145時(shí)，其表達(dá)量都下降了，說明miR143和miR145不能通過非經(jīng)典Wnt調(diào)控成肌分化。
　　以上結(jié)果

7、表明在C2C12細(xì)胞分化過程中，miR143和miR145對細(xì)胞分化早期調(diào)節(jié)因子有促進(jìn)作用，但不能在細(xì)胞分化末期促進(jìn)細(xì)胞分化后期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，而且會抑制成肌標(biāo)志基因的表達(dá)。本研究還表明miR143和miR145會抑制肌纖維類型的分化，但能在細(xì)胞分化中期促進(jìn)經(jīng)典Wnt通路蛋白LRP5、Axin2、和β-catenin的表達(dá)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中miR143和miR145并未如期作用促進(jìn)成肌分化，所以miR143和miR145對C2C12細(xì)胞分化的